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单细胞测序技术服务 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 单细胞全转录组测序 |
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生物分子凝聚体研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 CoIP-MS/AP-MS |
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NGS测序技术服务 DRIPc-seq |
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NGS测序技术服务 环状DNA测序 |
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基因芯片技术服务 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表观转录组学测序服务 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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NGS测序技术服务 DNA（羟）甲基化测序（抗体法） DNA甲酰基胞嘧啶(5fc)修饰测序 DNA 5hmC 测序（化学法） 染色质免疫共沉淀测序 |
PCR技术服务 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖体-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
作者单位：中山大学肿瘤防治中心
作者运用Arraystar Human CircRNA芯片发现具有m6A修饰的circNSUN2通常在结直肠癌肝转移病人的组织和血清中表达上调并与预后不良相关。体内实验证明circNSUN2上调可促进小鼠结直肠癌的肝转移；circNSUN2的m6A修饰促进circRNA运输到细胞质，进而形成circNSUN2/HMGA2 mRNA/IGF2BP2复合物增加HMGA mRNA稳定性，促进结直肠癌转移过程。临床实验证明在肝转移的结直肠癌病人组织与原位瘤相比circNSUN2和HMGA2表达上调。这些实验结果表明m6A修饰的circNSUN2调控该环状RNA的细胞质运输过程并促进HMGA2 mRNA稳定性从而促进结直肠癌肝转移，circNSUN2可作为疾病诊断的biomarker及治疗的潜在靶点。相关研究成果发表在Nature子刊Nature Communications（IF：11.878）上（芯片实验由康成生物提供技术服务）
研究背景
结直肠癌（CRC）是世界范围内发生率第三且癌症致死率第二位的疾病，临床上癌症转移是结直肠癌病人致死的主要因素，且肝脏是高频远端转移器官。约15-25%病人被诊断伴随肝转移，其预后生存期不超过5年。结直肠癌肝转移是个循序渐进过程，包括原位瘤的增殖、血液循环系统的运输、与肝血窦黏附、肝内增殖。 尽管前期研究发现很多分子表达的异常（例如lncRNA等）在结直肠癌肝转移过程发生重要作用，其精确的分子调控机制仍然不为人知。
CircRNA是pre-mRNA反向拼接形成的闭合单链RNA，近二十年间一直被认为是拼接错误产物，无重要功能，但随着测序和生信分析方法的改善，大量circRNA被鉴定出来，很多在组织或疾病进程中有表达特异性。circRNA在多种癌症发生过程具有表达差异，从作用机制上，circRNA可以通过吸附miRNA影响靶mRNA表达、可以影响mRNA的转录或可变剪切、可以编码蛋白发挥作用，具有重要调控功能及作为biomarker的潜力。m6A修饰是真核生物mRNA和ncRNA上丰度最高的修饰类型。CircRNA上的m6A修饰分布模式与mRNA有很大区别，但m6A修饰对circRNA的影响未知，circRNA的m6A修饰、circRNA在结直肠癌肝转移中的作用都有待进一步研究。
实验思路
作者首先利用Arraystar Human circRNA芯片筛选了2对结直肠癌与癌旁组织中差异表达的circRNA，由于拷贝数变异（CNV）是癌症发生的重要诱因，作者挑选circRNA时参考了上调circRNA转录的基因位置有拷贝数增加、下调circRNA转录位置有拷贝数减少且差异倍数不低于1.3，共筛选到9个差异circRNA。在97对CRC组织的qPCR验证后，发现其中4个circRNA表达趋势与芯片筛选相符，通过生存分析发现，circRNA_103783高表达的病人预后更差且与淋巴结转移高度相关，而淋巴结转移是肝转移的重要预兆，因此作者收集25对肝转移病人、18例正常、22例原位瘤组织，发现circRNA_103783在正常、原位瘤、肝转移病人结直肠、肝组织表达逐渐升高，血清验证趋势一致。circRNA_103783由NSUN2基因位置转录生成，因此命名为circNSUN2进行后续研究。
功能实验发现，In vivo过表达/敲除circNSUN2可以促进/抑制人源移植瘤结直肠癌小鼠模型的肝转移和肺转移；In vitro敲除circNSUN2可以抑制结直肠癌细胞的转移和侵袭。为了深入研究circNSUN2作用机制，作者利用RNA pull down联合质谱分析发现circNSUN2可以结合YTHDC1和IGF2BP2蛋白，利用YTHDC1或IGF2BP2抗体做反向RIP验证发现这两个蛋白也能结合circNSUN2。
由于YTHDC1是已知的m6A识别蛋白，作者分析该环状可能发生m6A修饰，利用MeRIP-qPCR确定circNSUN2具有m6A修饰，突变GAACU修饰位点，YTHDC1与circNSUN2结合减弱。前期研究发现YTHDC1可以促进m6A修饰的mRNA有细胞核转运到细胞质，作者利用分离核质RNA及FISH定位实验发现，circNSUN2核质都分布，胞质含量高，敲除YTHDC1后circNSUN2核内滞留增加，回复WT YTHDC1促进circNSUN1向胞质转运，证明YTHDC1结合m6A修饰的circNSUN2促进其胞质转运过程。
由于IGF2BP2是已知结合mRNA促进其稳定性的蛋白，作者推测该环状可能与IGF2BP2共同促进下游某些mRNA稳定。敲除circNSUN2前后做RNA seq，发现644个mRNA表达下调；利用数据库IGF2BP2的CLIP-seq结果找其结合的mRNA与644个mRNA取交集，发现22个mRNA既能结合IGF2BP2又能受circNSUN2调控，通过qRT-PCR和WB验证，确定HMGA2 mRNA与前期筛选趋势相符，已知该基因可以促进上皮间质转化（EMT）来促进结直肠癌进程，作者再通过RNA pull down、luciferase实验、FISH验证HMGA2 mRNA和circNSUN2可以直接结合，因此circNSUN2与IGF2BP2共同结合HMGA2 mRNA促进其稳定性。
作者在临床97个结直肠癌病人中检测circNSUN2与HMGA2发现两者有较高共表达关系，在20对转移瘤与原位瘤检测发现HMGA2在癌症转移过程表达升高。
技术路线
结果展示
图1 结直肠癌和癌旁中有拷贝数变异基因位置差异表达circRNA聚类图
图2 不同癌症发展阶段circNSUN2和调控的HMGA2的qPCR验证
图3 功能实验circRNA敲除及靶mRNA过表达影响肿瘤发生发展
图4 m6A修饰circNSUN2结合YTHDC1影响胞质转运及结合IGF2BP2影响HMGA2稳定性
图5 m6A修饰的circNSUN2影响结直肠癌转移侵袭机制图
研究意义
作者利用Arraystar Human circRNA芯片检测发现结直肠癌发生过程中circNSUN2有表达升高且该环状RNA会发生m6A修饰，并进行了qPCR及merip-PCR验证，功能实验证明circNSUN2上调可促进结直肠癌的肝转移过程；机制实验证明circNSUN2发生m6A修饰可以结合m6A识别蛋白YTHDC1促进胞质运输，进入胞质的circNSUN2结合IGF2BP2蛋白与HMGA2 mRNA最终促进HMGA2 mRNA稳定性及结直肠癌肝转移。临床验证发现circNSUN2和HMGA2 mRNA在结直肠癌转移过程表达升高，可作为结直肠癌肝转移的潜在biomarker。
原文出处
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检测发生m6A修饰的环状RNA；定量修饰百分比及修饰变化；total RNA要求量可低至3ug。
技术成熟，环状RNA反向接合位点设计引物，特异性检测目标RNA。
环状RNA m6A 甲基化PCR检测（circRNA-MeRIP PCR）：
m6A抗体富集发生m6A修饰的RNA+RNase R消化线性RNA+环状RNA反向接合位点设计引物保证 m6A-环状RNA的精确检测。
