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背景介绍:
单细胞转录组测序(Single-cell RNA Sequencing, scRNA-seq)是指在单细胞水平上进行高通量RNA测序的一种新技术,可以解决混杂样本测序(bulk RNA seq)所无法得到的细胞异质性信息。
临床组织是各种细胞的混合物,以肿瘤为例,肿瘤中心细胞,边缘细胞和远端转移细胞的细胞类型及转录组存在差异。传统的bulk RNA-seq提取组织或一群细胞的混合RNA进行测序,得到所有细胞的平均基因表达,掩盖了单个细胞的表达特异性,而scRNA-seq能够有效解决细胞异质性问题,通过检测单个细胞的表达谱,鉴定细胞类群,深入研究肿瘤转移侵袭、瘤内异质性、微环境重编程和耐药,近几年来已广泛应用于肿瘤,免疫,生长,发育等生物研究领域。
实验平台和原理
引入颇受行业内认可的BD RhapsodyTM单细胞分析系统,可快速平行分析成千上万个单细胞内数千基因的表达水平。该系统利用微孔法进行单细胞的分离和标记,一张微孔板上有不少于20万的特定大小微孔,每一个微孔可捕获一个细胞并装载一个磁珠,之后使用配套试剂盒进行细胞裂解、cDNA合成和文库构建。
实验流程图
样品类型:组织100-200mg,单细胞悬液细胞数目不少于1×105个;
质控要求:活细胞比例一般不低于65%;
1.细胞聚类及细胞类群鉴定
基于无监督算法,对所有细胞进行聚类分析,并通过不同细胞特异性marker基因进行细胞类型鉴定,使用t-SNE降维算法进行绘图展示,图中每个点代表一个细胞,相同颜色为一个细胞类群,从而将肿瘤细胞与其它细胞分开,分别进行差异基因表达分析。
2.特定细胞类群的差异表达火山图
对各细胞类型筛选得到的差异表达基因进行火山图展示,下图为肿瘤细胞类群单独进行差异表达分析的火山图,从而可以针对肿瘤细胞的差异基因进行功能分析。
3.特定细胞类群的GSVA分析
对肿瘤细胞类群进行GSVA分析的差异通路条形图。横坐标为GSVA分数的t值,表示各通路基因集在不同分组的表达差异度。纵坐标为差异通路,可以选择肿瘤细胞通路的差异基因,在肿瘤细胞系进行功能机制研究。
4.各细胞类型sub-cluster分析
基于前面所有细胞的分类结果,我们对每个细胞类群分别进行sub-cluster再分类,例如对肿瘤细胞的sub-cluster t-SNE及sub-GSVA分析,获得特异性聚集到肿瘤高增殖和侵袭通路的亚群,可以指导用药。