CHIRP – MS-康成生物丨数谱生物

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CHIRP – MS

简介
实验流程
CHIRP-MS结果
案例展示

CHIRP (Chromatin Isolation by RNA Purification) 技术可以用来研究lncRNA /circRNA-蛋白互作。作为基因组DNA的直接产物，RNA对生命活动有着至关重要的意义，是生命活动的另一执行者，其功能包括：1、参与蛋白质的合成；2、参与转录后修饰和DNA修复；3、参与基因表达调控等。通常ncRNA不能独立行使功能，往往需要有与之对应的相互作用蛋白共同执行特定的生理功能。

基于CHIRP技术，数谱生物提供CHIRP–MS服务将富集的靶标RNA结合的蛋白进行质谱检测。

技术优势
探针结合内源的靶标RNA分子，特异性高；
富集在细胞内与靶标RNA原位结合的蛋白，反映细胞内真实互作状态；
可以与CHIRP DNA-Seq同时进行试验，探索与靶标RNA共同互作的DNA和蛋白质
lncRNA、circRNA等常采用CHIRP-MS/DNA-seq富集结合的蛋白和DNA序列。生物样品在原位进行甲醛可逆交联，随后用biotin标记的RNA anti-sense（预先固定）进行杂交（Control组采用非特异探针）富集结合的蛋白和DNA。通过强变性条件洗去非特异结合蛋白后，得到的RBP经LC-MS/MS鉴定和定量分析，富集得到的RBP经LC-MS/MS鉴定和定量分析，与目标RNA特异性相互作用的蛋白（A, B, C, D）在两组间具有显著差异，非特异相互作用蛋白（X）在两组间比例接近1：1。据此构建目标RNA的相互作用蛋白谱。富集的DNA通过试剂盒抽提，进行建库测序，获得ncRNA结合的DNA区域和富集程度的信息，据此分析目标RNA调控转录的相互作用DNA区域。

图2 CHIRP–MS/CHRIP DNA-Seq实验流程图
1.CHIRP特异性富集的蛋白列表：

2.CHIRP特异性富集的蛋白GO/pathway分析

3. CHIRP特异性富集蛋白PPI互作网络图
运用ChIRP-MS技术，Stanford大学的科研人员对Xist RNA的相互作用蛋白谱进行了研究，发现81种Xist RNA相互作用蛋白，对Xist的功能行使具有重要意义。[2]
首先，为了对ChiRP-MS方法进行验证，作者选择了两种已知的snRNA，U1/U2（参与剪接体的组装）进行验证实验。U1/U2具有很高的表达量，同时，剪接体的组分研究得较为清楚，另外，U1/U2在抑制未成熟mRNA的剪接和poly-A化方面的作用已见报道，预示着更多未知的相互作用蛋白可能被鉴定到，因此U1/U2很适用于ChIRP-MS方法验证。针对U1/U2设计anti-sense RNA进行ChIRP-MS实验，结果如下：U1和U2分别富集了418和370个蛋白，其中113个已知的剪接体蛋白（共143个）(c)。

相互作用网络图进一步展示了U1/U2互作蛋白富集情况：位于上部的为已知蛋白，主要为剪接体蛋白，位于下方的为功能未知蛋白，包括只与U1或U2互作的蛋白以及和两者共同作用的蛋白。ChIRP-MS技术不仅能够很好的鉴定已知的RNA互作蛋白，同时也能鉴定未知蛋白，是研究RNA-protein相互作用的强大工具。

参考文献：
1.Rinn, J. L. & Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annual review of biochemistry 81, 145-166, doi:10.1146/annurev-biochem-051410-092902 (2012). [PMID: 22663078].
2. Chu, Ci et al. “Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.” Cell vol. 161,2 (2015): 404-16. doi:10.1016/j.cell.2015.03.025 [PMID: 25843628].

CHIRP – MS

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