CHIRP-seq

  • 简介
  • 实验流程
  • CHIRP-DNA-seq结果
  • 案例展示
  • CHIRP (Chromatin Isolation by RNA Purification) 技术可以用来研究lncRNA /circRNA-蛋白互作。作为基因组DNA的直接产物,RNA对生命活动有着至关重要的意义,是生命活动的另一执行者,其功能包括:1、参与蛋白质的合成;2、参与转录后修饰和DNA修复;3、参与基因表达调控等。通常ncRNA不能独立行使功能,往往需要有与之对应的相互作用蛋白共同执行特定的生理功能。

    基于CHIRP技术,数谱生物提供CHIRP – MS服务将富集的靶标RNA结合的蛋白进行质谱检测、 CHRIP DNA-Seq服务将富集的靶标RNA结合的DNA进行测序。


    技术优势
    探针结合内源的靶标RNA分子,特异性高;
    富集在细胞内原位与目的RNA结合的蛋白,反映细胞内真实互作状态;
    既可以富集靶标RNA结合的蛋白进行质谱检测,也可以富集靶标RNA结合的DNA进行测序;

  • lncRNA、circRNA等常采用CHIRP-MS/DNA-seq富集结合的蛋白和DNA序列。生物样品在原位进行甲醛可逆交联,随后用biotin标记的RNA anti-sense(预先固定)进行杂交(Control组采用非特异探针)富集结合的蛋白和DNA。通过强变性条件洗去非特异结合蛋白后,得到的RBP经LC-MS/MS鉴定和定量分析,富集得到的RBP经LC-MS/MS鉴定和定量分析,与目标RNA特异性相互作用的蛋白(A, B, C, D)在两组间具有显著差异,非特异相互作用蛋白(X)在两组间比例接近1:1。据此构建目标RNA的相互作用蛋白谱。富集的DNA通过试剂盒抽提,进行建库测序,获得ncRNA结合的DNA区域和富集程度的信息,据此分析目标RNA调控转录的相互作用DNA区域。



    图2 CHIRP–MS/CHRIP DNA-Seq实验流程图

  • 1.CHIRP特异性富集的DNA区域列表







    2. CHIRP结合DNA所在基因GO/pathway分析













    3.CHIRP结合DNA的可视化图

  •        运用ChIRP-MS技术 ,Stanford大学的科研人员对Xist RNA的相互作用蛋白谱进行了研究,发现81种Xist RNA相互作用蛋白,对Xist的功能行使具有重要意义。[2]
           首先,为了对ChiRP-MS方法进行验证,作者选择了两种已知的snRNA,U1/U2(参与剪接体的组装)进行验证实验。U1/U2具有很高的表达量,同时,剪接体的组分研究得较为清楚,另外,U1/U2在抑制未成熟mRNA的剪接和poly-A化方面的作用已见报道,预示着更多未知的相互作用蛋白可能被鉴定到,因此U1/U2很适用于ChIRP-MS方法验证。针对U1/U2设计anti-sense RNA进行ChIRP-MS实验,结果如下:U1和U2分别富集了418和370个蛋白,其中113个已知的剪接体蛋白(共143个)(c)。


    相互作用网络图进一步展示了U1/U2互作蛋白富集情况:位于上部的为已知蛋白,主要为剪接体蛋白,位于下方的为功能未知蛋白,包括只与U1或U2互作的蛋白以及和两者共同作用的蛋白。ChIRP-MS技术不仅能够很好的鉴定已知的RNA互作蛋白,同时也能鉴定未知蛋白,是研究RNA-protein相互作用的强大工具。


    参考文献:
    1.Rinn, J. L. & Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annual review of biochemistry 81, 145-166, doi:10.1146/annurev-biochem-051410-092902 (2012). [PMID: 22663078].
    2. Chu, Ci et al. “Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.” Cell vol. 161,2 (2015): 404-16. doi:10.1016/j.cell.2015.03.025 [PMID: 25843628].