TREX-MS (Customer-specified RNA Region)

  • 简介
  • 技术独特性与优势
  • 技术路线
  • 结果展示
  • 案例展示
  • 2024年《Nature Methods》发表了题为”TREX reveals proteins that bind to specific RNA regions in living cells“的文章,该文章提出了可以鉴定特定RNA区域与RBPs互作的新方法-TREX。TREX(Targeted RNase H-mediated Extraction of Crosslinked RBPs)是一种基于紫外交联和RNase H酶切的实验方法,专为在细胞中无偏倚捕获特定RNA区域所结合蛋白质(RNA-binding proteins, RBPs)而设计。不同于CHIRP-MS实验捕获整条RNA上的所有结合蛋白(图 1A),TREX-MS能够精准捕获RNA较短目标区域上的结合蛋白(图 1B),具有高特异性和高灵敏度,为精确解析疾病状态以及生长发育等生物学过程中转录因子等蛋白对RNA的调控提供关键信息。
    图 1. CHIRP-MS与TREX-MS 捕获不同范围的RNA互作蛋白。(A)CHIRP-MS捕获整条RNA上的所有RNA互作蛋白;(B)TREX-MS精准捕获RNA较短目标区域上的RNA互作蛋白。
  • 1、技术独特性:

    RNase H酶切高效性:利用RNase H特异性切割“RNA-DNA”杂交链中的RNA链,释放此RNA链杂交区域的结合蛋白,反应具有高效性。

    靶RNA区域选择性:可针对性研究目标转录本上某一特定区域的RNA互作蛋白。

    2、技术优势: 

    高特异性:通过设计特异性DNA探针,精准靶向目标RNA序列,释放并富集靶RNA区域的结合蛋白,有效避免非特异性结合蛋白的污染。

    高灵敏度:与传统的RNA亲和捕获法相比,单次实验需要的起始细胞量减少。
    紫外交联增强稳定性:通过紫外交联固定RNA与蛋白质的相互作用,确保即便是弱相互作用或瞬时结合的分子也能被有效固定。
  • 1.紫外交联:
    用UV-C紫外光照射细胞或组织样本,使RNA与其结合蛋白形成共价交联;

    2.细胞裂解和相分离:

    采用有机相分离技术在变性条件下裂解样本,可维持RNA-蛋白质复合物的完整性并实现有效回收。

    3.靶RNA降解:
    使用反义DNA寡核苷酸探针与目标RNA区域进行特异性杂交;
    利用RNase H特异性降解目标RNA区域,从而释放结合的RBPs;
    4.相分离与蛋白富集:
    通过二次有机相分离,富集直接结合在靶RNA区域的蛋白质;
    5.质谱分析:

    采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行蛋白质组学分析,鉴定RBPs。

    图 2 TREX实验流程

  • 1.质谱检测结果



    2.差异蛋白GO分析



    3.差异蛋白KEGG pathway分析


    4.String蛋白质互作网络分析




  • 案例1:探究NORAD LncRNA ND4区域互作蛋白组

    NORAD是一种长度为5.3 kb的长链非编码RNA,在大多数人体组织和细胞中呈现高表达[1]。研究表明,NORAD在DNA损伤条件下表达显著上调,其主要生物学功能是维持基因组稳定性[2]。NORAD包含5个重复区域(ND1-ND5),其中ND4区域呈现高度保守性,然而其直接互作蛋白尚未完全阐明。研究人员采用TREX-MS技术,采用9条反义寡核苷酸探针对ND4区域进行全覆盖杂交,成功鉴定出360个相互作用蛋白,包括已知的PUM1蛋白以及新型相互作用因子RBMX、TOP1等[3]。

    TREX-MS鉴定与NORAD的ND4片段相结合的蛋白质


    参考文献
    [1] Lee, S. et al. Noncoding RNA NORAD regulates genomic stability by sequestering PUMILIO proteins. Cell 164, 69–80 (2016).
    [2] Munschauer, M. et al. The NORAD lncRNA assembles a topoisomerase complex critical for genome stability. Nature 561, 132–136 (2018).
    [3] Dodel, M. et al.TREX reveals proteins that bind to specific RNA regions in living cells. Nat Methods 21, 423–434 (2024).