DNA羟甲基化测序-康成生物丨数谱生物

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DNA羟甲基化测序

简介
技术优势
实验流程
结果展示
客户案例

DNA羟甲基化是一种重要的表观遗传修饰，对基因的表达起调控作用，在神经分化和癌症中发挥重要的作用。为深入了解5hmC的作用，我们就必须清楚5hmC在基因组的分布情况。然而，传统的基于重亚硫酸盐的方法无法区分5-hmC和5-mc。5-hmC单克隆抗体捕获法是研究DNA羟基化修饰的利器，结合高通量测序技术以及生物信息分析，可以获得全基因组羟甲基化分布图，从而能帮助我们从一个新的角度来解析胚胎发育，神经细胞分化以及癌症发生的分子机制。

Aksomics（原康成生物）为您提供羟甲基化测序技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，Aksomics的技术服务人员就可为您完成全部实验操作，包括超声打断基因组、羟甲基化DNA免疫共沉淀、hMeDIP与 Input DNA文库构建、高通量测序和数据分析、并提供完整的实验报告。
● 特异性检测羟甲基化： 5-hmC抗体能够区分甲基化和羟甲基化信号，特异性的检测羟甲基化区域。

● 灵活度高：能够直接对任意物种的高羟甲基化片段进行测序，无需已知的基因组序列信息。

● 检测范围广：覆盖整个基因组范围的羟甲基化区域。

● 精确度高：能够在实际结合位点50个碱基范围内精确定位。

● 数字化信号：直接对羟甲基化片段进行测序和定量，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。
1.  羟甲基化DNA免疫共沉淀（hMeDIP）

2. 测序文库构建

3.  DNA成簇（Cluster）扩增

4.  高通量测序

5.  数据分析

6.  提供实验报告
全基因组羟甲基化谱

1.  羟甲基化峰识别：通过MACS软件，可以利用与基因组匹配的read来识别羟甲基化峰，常用的MACS2筛选参数：q-Value≤10^-4。

1. * mRNA相关的羟甲基化峰识别

* lncRNA相关的羟甲基化峰识别

* Small_ncRNA相关的羟甲基化峰识别

上表：全基因组羟甲基化谱数据列表

差异羟甲基化区域

1.  识别差异羟甲基化基因

       通过diffReps软件，Aksomics对不同样品或样品组间的基因启动子区域的差异羟甲基化进行了分析，常用的diffReps筛选参数是：log2FC≥1, p-value≤10^-4 。为了对羟甲基化水平进行定量分析，处理组和对照组的样品分别通过相应的input样品进行标准化。根据处理组样品羟甲基化水平相对对照组的上下调情况，这些在启动子区域差异羟甲基化的基因被分成了“高羟甲基化（hyper-hydroxymethylation）”和“去羟甲基化（hypo-hydroxymethylation）"基因。

* mRNA相关的启动子区域差异羟甲基化基因列表

* lncRNA相关的启动子区域差异羟甲基化基因列表

* Small_ncRNA相关的启动子区域差异羟甲基化基因列表

上表：全基因组差异羟甲基化数据列表

2.  Enhancer & Super-enhancer相关的基因间差异羟甲基化列表

*Enhancer 相关的基因间差异羟甲基化基因列表

*Super-Enhancer 相关的基因间差异羟甲基化基因列表

上表：增强子和超级增强子相关的基因间差异羟甲基化列表

3.  差异羟甲基化基因的聚类分析

       聚类分析对于理解差异羟甲基化基因的功能、调控是十分有帮助的。具有相似羟甲基化模式的样品能够被聚类在一起，以揭示难以用传统方法鉴定的潜在信息。

上图：差异羟甲基化的基因聚类分析实例。

4.  差异羟甲基化基因的GO分析

       为了方便客户了解启动子差异羟甲基化基因的功能，Aksomics还分别提供了去羟甲基化基因和超羟甲基化基因的GO分析。

5.  差异羟甲基化基因的Pathway分析

       为了方便客户了解启动子差异羟甲基化基因参与的生物学过程，Aksomics还分别提供了去羟甲基化基因和超羟甲基化基因的Pathway分析。

可视化

       Aksomics提供WIG格式的hMeDIP-Seq羟甲基化谱数据，可以通过UCSC浏览器或IGB浏览器进行可视化。通过可视化话图，客户可以直观的了解具体区域或基因的羟甲基化情况，已经样品间的差异羟甲基化状况。
Loss of 5-hydroxymethylcytosine is an epigenetic hallmark of melanoma.Cell2012

研究者先用免疫组化的方法证明黑素素瘤组织和正常痣相比羟甲基化程度降低。对70个病人的DNA羟甲基水平进行检测，结合临床数据证明DNA羟甲基化水平可以作为黑色素瘤的预后标志物。然后采用hMeDIP-seq的方法，在全基因组范围内研究黑色素瘤羟甲基化变化的分布位点。5-hmC是5-mC在TET酶的催化作用下转化而来的，因此研究者进一步结合hMeDIP-seq的数据，找到5-hmC水平降低（>5倍）同时5-mC水平降低（<2倍）的基因2，144个。进而通过pathway分析，发现这些基因主要富集在wnt signal pathway，细胞连接等和黑色素瘤相关的信号通路中（图7），从一个方面说明了癌症发生的分子机制。应用hMeDIP-PCR的方法对IGF1R,RAC3, TIMP2基因进行了羟甲基化水平的检测，验证了测序结果的准确性。

接着，研究者找到了黑色素瘤中整体羟甲基化水平降低的根本原因：羟甲基化形成的关键酶TET2，IDH2表达量在黑色素瘤组织中表达下调。用黑素素瘤斑马鱼活体实验证明，恢复IDH2的表达，可以使癌组织中DNA羟甲基化的水平升高，并且使动物模型的无病生存期延长。进一步进行细胞水平的实验，在黑素素瘤细胞中过表达TET2，结果表明黑色素瘤在过表达TET2后，增殖和侵袭能力降低。应用hMeDIP-seq对过表达TET2的黑色素瘤细胞和对照细胞进行羟甲基化检测，发现30%在黑色素瘤中羟甲基化水平降低区域在过表达TET2后羟甲基化水平得到恢复。Pathway分析表明过表达TET2后羟甲基化水平恢复的基因聚集在MAPK等重要的信号通路中。该成果发表在Cell上，IF31.957。

技术路线：

结果展示：

上图：黑色素瘤细胞中关键基因发生羟甲基化水平变化。A：UCSC可视化结果展示。黑色素瘤和痣组织相比整体羟甲基化水平减低，羟甲基化水平不变。B：对黑色素瘤和痣组织中检测到的DNA羟甲基化位点和羟甲基化位点进行分类统计。黑色素瘤与痣组织相比，在启动子，外显子，内含子，基因间等区域羟甲基化水平下降，羟甲基化水平基本不变。 C: 基因内部（Gene body）及周边(向两端各延伸20%)区段内的羟甲基化和羟甲基化reads（读段）密度分布。可以看到在黑色素瘤中，Gene body 内羟甲基化水平降低。E: 韦恩图显示癌组织中在Gene body区域羟甲基化水平降低同时羟甲基化水平升高的基因有2，144个。对这些基因进行pathway分析，发现变化的基因主要聚集在癌症相关的信号通路中。F： UCSC可视化结果展示，在RAC3, IGF1R, TIMP2中羟甲基化水平降低，羟甲基化水平升高。 G：hMeDIP-PCR对RAC3，IGF1R，TIMP2进行验证，证明在黑色素瘤中这些基因的羟甲基化水平降低，验证了测序的结果。

上图：过表达TET2后部分关键基因的羟甲基化水平得到恢复。构建TET2过表达的黑素素瘤细胞系，同时构建TET突变的细胞系作为对照。通过hMeDIP-seq检测，发现过表达TET2的细胞vs对照细胞 80%(12，752/15835)的羟甲基化升高的位点与黑色素瘤组织vs痣组织羟甲基化水平降低的位点重叠。将重叠的位点按照与基因的相对位置分成启动子和Gene body两个部分，分别进行GO和pathway分析。启动子重叠的基因聚集在信号传导，TGF-beta等重要的功能分类中；Gene body重叠的基因集中在MAPK，细胞黏附等重要的通路中。

DNA羟甲基化测序

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