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单细胞测序技术服务 靶向单细胞测序（lncRNA&mRNA） 单细胞测序 |
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生物分子凝聚体研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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核糖体-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC-seq |
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蛋白表达定量 Label free非标定量 TMT标记定量 PRM靶向定量 |
意大利血液治疗部门细胞再生医学实验室Lorenza Lazzari教授长期从事干细胞特性与治疗的相关研究。该课题组利用Arraystar circRNA芯片发现circFOXP1可维持间充质干细胞（MSCs）的特性和分化能力。体内体外功能实验证实，敲低circFOXP1明显抑制间充质干细胞的分化。最后机制研究发现，circFOXP1与miR-17-3p/miR-127-5p相互作用，调控非经典Wnt与EGFR信号通路。对MSCs多能性进行重编程，发现circFOXP1与非经典Wnt信号通路下调，经典Wnt信号通路则显著增强。意味着circFOXP1是干细胞分子网络中的重要分子。该研究成果发表在学术期刊Nucleic Acids Research上（IF:11.14）。(芯片实验由Arraystar提供技术服务)
研究背景
人间充质干细胞（MSCs）是能够分化成多种类型细胞的多能性干细胞，可以从成人或未出生婴儿的各种组织中分离得到，体外培养时，MSCs能够进行自我更新或定向分化成中胚层组织细胞，比如骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞。因此MSCs被用来治疗骨损伤等疾病，具有重要的临床应用价值。然而对于维持MSCs的特性背后的分子机制仍有待深入研究。
circRNA是一类将线性RNA分子的3’端和5’端通过共价连接形成的环形RNA分子，可以由外显子、内含子或者同时包含两种序列的片段组成。与线性分子相比，这种环形的结构可促进circRNA的稳定性。circRNA发挥功能的方式也有大量的研究，最主要的是一些circRNA分子可作为miRNA的内源性竞争吸附海绵，间接调控细胞表型。
研究思路
文章着重于研究circFOXP1在间充质干细胞的干性维持过程中的功能与机制研究，运用Arraystar circRNA芯片检测了成人造血干细胞、脐带血干细胞与人皮肤成纤维细胞中差异表达的circRNA分子。通过p值≤0.05与差异倍数(FC值)≥1.5进行筛选后，挑选表达差异最显著的circRNA分子进行PCR验证和一代测序，最终确定hsa_circ_0001320(circFOXP1)进行后续研究。
为了研究circFOXP1在MSCs细胞中的功能，作者构建了circFOXP1的基因敲除细胞模型，发现间充干细胞的表面标志物在敲除circFOXP1后表达量明显降低。敲低circFOXP1，可抑制MSCs向成骨细胞与脂肪细胞的分化。在大鼠股骨萎缩型骨不愈合模型中，敲低circFOXP1明显降低大鼠骨愈合程度。
为了研究circFOXP1在MSCs中发挥功能的作用机制，作者通过生信预测发现circFOXP1能够吸附大量的miRNA分子，通过双荧光素酶实验发现过表达miR-17-3p、miR-127-5p、miR-370-3p能明显抑制荧光素酶的表达。RNA pull down实验发现在富集circFOXP1同时，也可以显著将miR-17-3p、miR-127-5p、miR-370-3p三个miRNA拉下来，证明circFOXP1可直接与miRNA相互作用。对这三个miRNA的靶基因进行GO分析后，发现其靶基因可显著富集到EGFR与非经典的Wnt信号通路中，最终调控MSCs的干细胞特性维持。
技术路线：
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结果展示
图1、Arraystar Human circRNA芯片高通量筛选结果及验证。A 差异circRNA的聚类图；B 挑选差异表达的13个circRNA 做qPCR验证。
图2、敲低circFOXP1调控MSCs干细胞特性。A 核质分离检测circFOXP1主要定位在细胞质中；B 敲低circFOXP1降低MSCs干细胞特性细胞表面标志物的表达；C 敲低circFOXP1，抑制MSCs向成骨细胞的分化；D 敲低circFOXP1，抑制MSCs向脂肪细胞的分化。
图3、circFOXP1通过结合miRNA调控EGFR和非经典Wnt信号通路。A 双荧光素酶实验证实circFOXP1可结合miR-17-3p/miR-370-3p/miR-127-5p；B miR-17-3p/miR-370-3p/miR-127-5p靶基因GO富集分析。
图4、circFOXP1调控MSCs细胞特性的机制模式图。在间充质干细胞自我更新过程中，circFOXP1表达量上调，结合更多的miR12/miR127，抑制经典的Wnt信号通路；在分化过程中，circFOXP1表达量下调，miR17/miR127表达量上调，靶向WNT5A，激活非经典Wnt信号通路，促进MSCs干细胞分化。
研究意义
本课题利用Arraystar circRNA芯片研究circFOXP1在间充质干细胞特性维持过程中的功能与机制，证实了circFOXP1在MSCs细胞中具有重要作用。相比于分化的人皮肤成纤维细胞，造血干细胞、脐带血干细胞中circFOXP1显著上调。在敲除circFOXP1的MSCs细胞中，干细胞特性相关的自我更新与分化能力都有极大程度的降低。生信分析与双荧光酶实验证实，circFOXP1可通过结合miR-17-3p/miR-127-5p间接调控EGFR与非经典的Wnt信号通路，维持MSCs细胞的干性。
原文出处
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