Arraystar 环状RNA芯片应用丨circFOXP1通过与miRNA相互作用调控间充质干细胞的干性维持

意大利血液治疗部门细胞再生医学实验室Lorenza Lazzari教授长期从事干细胞特性与治疗的相关研究。该课题组利用Arraystar circRNA芯片发现circFOXP1可维持间充质干细胞(MSCs)的特性和分化能力。体内体外功能实验证实,敲低circFOXP1明显抑制间充质干细胞的分化。最后机制研究发现,circFOXP1miR-17-3p/miR-127-5p相互作用,调控非经典WntEGFR信号通路。对MSCs多能性进行重编程,发现circFOXP1与非经典Wnt信号通路下调,经典Wnt信号通路则显著增强。意味着circFOXP1是干细胞分子网络中的重要分子。该研究成果发表在学术期刊Nucleic Acids Research上(IF:11.14)。(芯片实验由Arraystar提供技术服务)

研究背景

人间充质干细胞(MSCs)是能够分化成多种类型细胞的多能性干细胞,可以从成人或未出生婴儿的各种组织中分离得到,体外培养时,MSCs能够进行自我更新或定向分化成中胚层组织细胞,比如骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞。因此MSCs被用来治疗骨损伤等疾病,具有重要的临床应用价值。然而对于维持MSCs的特性背后的分子机制仍有待深入研究。

circRNA是一类将线性RNA分子的3’端和5’端通过共价连接形成的环形RNA分子,可以由外显子、内含子或者同时包含两种序列的片段组成。与线性分子相比,这种环形的结构可促进circRNA的稳定性。circRNA发挥功能的方式也有大量的研究,最主要的是一些circRNA分子可作为miRNA的内源性竞争吸附海绵,间接调控细胞表型。

研究思路

文章着重于研究circFOXP1在间充质干细胞的干性维持过程中的功能与机制研究,运用Arraystar circRNA芯片检测了成人造血干细胞、脐带血干细胞与人皮肤成纤维细胞中差异表达的circRNA分子。通过p≤0.05与差异倍数(FC)≥1.5进行筛选后,挑选表达差异最显著的circRNA分子进行PCR验证和一代测序,最终确定hsa_circ_0001320(circFOXP1)进行后续研究。

为了研究circFOXP1MSCs细胞中的功能,作者构建了circFOXP1的基因敲除细胞模型,发现间充干细胞的表面标志物在敲除circFOXP1后表达量明显降低。敲低circFOXP1,可抑制MSCs向成骨细胞与脂肪细胞的分化。在大鼠股骨萎缩型骨不愈合模型中,敲低circFOXP1明显降低大鼠骨愈合程度。

为了研究circFOXP1MSCs中发挥功能的作用机制,作者通过生信预测发现circFOXP1能够吸附大量的miRNA分子,通过双荧光素酶实验发现过表达miR-17-3pmiR-127-5pmiR-370-3p能明显抑制荧光素酶的表达。RNA pull down实验发现在富集circFOXP1同时,也可以显著将miR-17-3pmiR-127-5pmiR-370-3p三个miRNA拉下来,证明circFOXP1可直接与miRNA相互作用。对这三个miRNA的靶基因进行GO分析后,发现其靶基因可显著富集到EGFR与非经典的Wnt信号通路中,最终调控MSCs的干细胞特性维持。

技术路线:




结果展示

1Arraystar Human circRNA芯片高通量筛选结果及验证。A 差异circRNA的聚类图;B 挑选差异表达的13circRNA qPCR验证。

 

2、敲低circFOXP1调控MSCs干细胞特性。A 核质分离检测circFOXP1主要定位在细胞质中;B 敲低circFOXP1降低MSCs干细胞特性细胞表面标志物的表达;C 敲低circFOXP1,抑制MSCs向成骨细胞的分化;D 敲低circFOXP1,抑制MSCs向脂肪细胞的分化。

 

3circFOXP1通过结合miRNA调控EGFR和非经典Wnt信号通路。A 双荧光素酶实验证实circFOXP1可结合miR-17-3p/miR-370-3p/miR-127-5pB miR-17-3p/miR-370-3p/miR-127-5p靶基因GO富集分析。

4circFOXP1调控MSCs细胞特性的机制模式图。在间充质干细胞自我更新过程中,circFOXP1表达量上调,结合更多的miR12/miR127,抑制经典的Wnt信号通路;在分化过程中,circFOXP1表达量下调,miR17/miR127表达量上调,靶向WNT5A,激活非经典Wnt信号通路,促进MSCs干细胞分化。

研究意义

本课题利用Arraystar circRNA芯片研究circFOXP1在间充质干细胞特性维持过程中的功能与机制,证实了circFOXP1MSCs细胞中具有重要作用。相比于分化的人皮肤成纤维细胞,造血干细胞、脐带血干细胞中circFOXP1显著上调。在敲除circFOXP1MSCs细胞中,干细胞特性相关的自我更新与分化能力都有极大程度的降低。生信分析与双荧光酶实验证实,circFOXP1可通过结合miR-17-3p/miR-127-5p间接调控EGFR与非经典的Wnt信号通路,维持MSCs细胞的干性。


原文出处

FOXP1 circular RNA sustains mesenchymal stem cell identity via microRNA inhibition. Nucleic Acid Research. 2019




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