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贵州医科大学曾柱教授课题组长期从事区域高发疾病方向肿瘤机制与肿瘤免疫治疗的研究。近期该课题组发表了名为“Aberrant R-loop–mediated immune evasion, cellular communication, and metabolic reprogramming affect cancer progression: a single-cell analysis”的研究性论文。文章应用肺腺癌(LUAD)的单细胞RNA测序数据集构建了一个R-loop评分模型,根据已识别的与EGFR突变、组织来源和TNM分期相关的R-loop调节因子,评估R-loop评分与肿瘤微环境(TME)和治疗反应之间的关系。结果显示,低R-loop评分的恶性细胞抑制了抗肿瘤治疗效果。细胞通讯分析表明,低R-loop评分显示出明显的T细胞耗竭。并且,课题组也利用跨33种肿瘤类型的单细胞数据验证了R-loop评分的预后价值,并用R-loop评分模型成功预测了肿瘤患者对靶向治疗、化疗或免疫治疗的治疗反应。此外,文章利用DRIP-seq等实验探索了FANCI介导的R-loop在LUAD中的潜在作用。值得注意的是,FANCI缺陷介导的R-loop分布变化抑制了Ras信号通路的活性,抑制了肿瘤细胞的增殖和传播。总之,该研究揭示了R-loop评分模式下代谢重编程和T细胞耗竭的潜在分子机制,以及R-loop调节因子介导的R-loop变化导致肿瘤进展。因此,将基于R-loop或R-loop调节因子的抗癌方法纳入精准医学的治疗方案可能是有益的。该研究成果于2024年1月发表在学术期刊Molecular Cancer (IF:37.3)上(DRIP-seq技术服务由康成|数谱生物提供)。
研究背景
R-loop是由转录的RNA链与双链DNA中打开的模板链发生碱基互补配对,形成RNA-DNA杂合链,同时使未配对的另一条DNA链游离在外组成的三链结构。R-loop在哺乳动物基因组中普遍存在,参与多种生物过程,生理性的R-loop有助于促进DNA修复、细胞增殖和分化、RNA转录和加工,以及动态调控基因表达和DNA甲基化。R-loop平衡的改变会破坏R-loop调控的过程,造成复制压力和基因组不稳定性增加,这些结果与各种人类疾病(包括癌症)的发生相关。因此在正常条件下,R-loop会受到细胞内各种因素的精细调控。目前已报道有1000多种控制R-loop结构和水平的R-loop调节因子,例如BRCA2、ZFP281、RnaseH等。对R-loop在健康和疾病中的功能作用的发现有助于开发针对人类疾病的新的靶向治疗策略。
由R-loop导致的基因组不稳定和复制压力是癌前和癌细胞的标志,是潜在的癌症驱动因子。许多研究表明,R-loop频率、稳定性或基因组位置的改变与癌症状态相关,例如原癌基因激活和抑癌基因失活。癌细胞存在于肿瘤微环境(TME),微环境中还有成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和髓样细胞等,调控着肿瘤的进展和对治疗的反应。已经报道R-loop在细胞质中的积累会激活与神经退行性疾病和癌症相关的先天免疫反应。在慢性炎症和癌变过程中,R-loop通过诱导免疫细胞相互作用的重组,调节细胞因子介导的炎症级联反应。虽然目前有直接证据显示R-loop本身导致肿瘤发生和进展的研究还很有限,R-loop在TME中的功能也仍然不清楚,但通过单细胞测序和DRIP-seq分析,我们可以深入了解R-loop在肿瘤组织内恶性和非恶性细胞之间以及TME其他细胞内的作用。
实验思路
研究意义
单细胞测序证明肺腺癌LUAD恶性细胞的R-loop评分与疾病进展相关
本为了探索R-loop与LUAD进展之间的关系,文章利用30个LUAD癌症样本的单细胞RNA测序数据进行分析,UMAP图显示LUAD样本包含B细胞、DC细胞、巨噬细胞等10种已知细胞类型(图1A)。通过评估转录组数据中的染色体拷贝数变异(CNVs),发现随着癌症发展,恶性上皮细胞的数量增加。根据1185个R-loop调节因子的表达数据,文章构建了一个R-loop评分模型来描述R-loop状态。来自转移样本的恶性细胞R-loop评分低,化疗患者恶性细胞的R-loop评分较高(图1B)。其中,R-loop低分组的高表达基因主要富集于与肿瘤进展相关的信号通路(图1C),因此R-loop可能在肿瘤进展中发挥了关键作用。
R-loop得分描绘了肿瘤免疫逃逸表型
为进一步了解R-loop是否可以影响控制肿瘤进展的关键因素:免疫逃逸,文章通过单细胞测序分析表明,R-loop低分细胞有肿瘤相关抗原(TAA)和主要组织相容性(MHC)分子的表达下调,免疫抑制因子表达上调(图2A)。利用GSEA分析文章发现R-loop低分组的免疫原性细胞死亡通路显著下调,功能失调的CD4+和CD8+ T细胞、耗竭NK细胞比例显著升高(图2BC)。这说明R-loop可以利用多种调节机制建立强大的免疫抑制微环境,支持肿瘤生长,促进肿瘤免疫逃逸,影响免疫疗法的有效性;文章还评估了R-loop得分与免疫疗法反应的关系,对anti-PD-1免疫疗法有反应的患者中,恶性细胞几乎完全聚集在R-loop高分组(图2D),进一步支持了R-loop得分可以鉴定肿瘤免疫逃逸表型,并作为肺腺癌中免疫疗法预后的预测因子。
R‑loop 重塑了肿瘤微环境中的细胞通讯,影响LUAD对靶向治疗(TKI)的反应及预后
考虑到细胞间相互作用对抗肿瘤具有关键作用,文章也利用单细胞测序数据的细胞通讯分析发现了R-loop得分与恶性细胞产生的趋化因子、共激活因子表达水平呈显著正相关(图3A),与共抑制因子显著负相关。鉴于肿瘤耐药性限制了TKI等药物的临床疗效,文章探索了靶向治疗是否受到R-loop的影响。根据TKI治疗患者的组织样本单细胞测序数据,PD(靶向治疗后出现进展性疾病状态)样本的恶性细胞R-loop得分低于RD(靶向治疗后出现完全或部分反应状态)样本(图3B)。因此,R-loop得分可成为判断TKI治疗疗效的强有力指标。
根据Kaplan-Meier生存分析和R-Loop评分结果,作者发现在LUAD及多种肿瘤中,R-loop高分组的预后优于低分组(图3C)。并且在GSVA分析中,R-loop 低分组样品也显示出肿瘤发展相关能量代谢途径的显著富集(图3D)。因此,R-Loop评分可以准确预测癌症治疗的预后情况。
DRIP-seq发现FANCI影响R-loop在LUAD中的分布,从而促进肿瘤的进展
FANCI是R-loop的关键调节因子之一,作者发现它在包括LUAD的几乎所有肿瘤类型中都上调表达,并且其高表达与不良预后密切相关。为了绘制LUAD细胞系PC-9的R-loop概况,并测试FANCI基因对R-loop分布的影响,文章首先使用S9.6抗体进行了DRIP-seq,发现R-loop在启动子区域的富集峰reads密度高于其他区域,在26,534个R-loop富集峰中,约一半位于基因间区,11.57%位于启动子和终止子。
文章进一步将FANCI基因敲低,发现R-loop峰在基因间区域(40.46%)、基因体(42.53%)、启动子(9.81%)和终止子(7.20%)等基因区域的分布显著降低(图4B)。而且,具有R-loop变化的基因在癌症发展相关信号通路(如Ras和MAPK信号通路)中显著富集(图4C)。因此,FANCI可能通过调节R-loop参与LUAD的进展。
FANCI功能机制研究
文章进一步在LUAD细胞中检测了Ras信号通路的活性,发现沉默FANCI明显削弱了Ras的活性,导致其下游的PI3K/AKT/NF-κB和MAPK/ERK被显著抑制。胞内功能实验表明,FANCI缺失显著抑制了PC-9和A549细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,促进了细胞凋亡(图5AB)。小鼠异种移植瘤实验表明,FANCI沉默限制了PC-9细胞在体内形成肿瘤的能力(图5C)。总的来说,由FANCI等R-loop调节因子介导的R-loop分布的变化可能导致LUAD的发展。
结果展示
1.单细胞测序证明肺腺癌LUAD恶性细胞的R-loop评分与疾病进展相关
图1: A.UMAP图显示LUAD病人单细胞测序鉴定到10种细胞类型;B. 箱型图显示R-loop score在不同状态和分期病人中的差异;C. GSVA分析显示恶性细胞中高和低R-loop score细胞富集的信号通路。
图2: A. ssGSEA分析显示高和低 R-loop 评分的亚组之间恶性细胞的免疫逃逸分子谱的变化;B. 柱形图显示高和低R-loop评分亚组之间T细胞亚型比例的差异;C. 箱型图显示高和低R-loop评分亚组之间NK细胞耗竭评分的差异;D. 箱型图显示免疫治疗后无反应NR和有反应R亚组之间R-loop评分的差异。
图3:A. 细胞通讯分析表明在R-loop得分与恶性细胞-T细胞亚型间趋化因子水平显著正相关;B. 箱型图显示靶向治疗后PD(疾病进展)样本和RD(完全或部分反应)样本的恶性细胞R-loop得分差异;C. KM曲线显示R-loop评分高和低的患者总生存率的差异。D. GSVA分析显示高和低R-loop评分的恶性细胞之间代谢通路的差异。
4. DRIP-seq高通量筛选结果展示
图4:A. DRIP-seq密度分布图显示PC-9细胞FANCI敲低明显降低了R-loop峰在基因区域及上下游5kb的分布;B. DRIP-seq饼型图显示PC-9细胞FANCI敲低前后启动子、基因、终止子、基因间区的R-loop分布差异;C. KEGG富集分析显示对照组和 FANCI 敲低组之间 R 环分布差异基因在癌症进展相关信号通路(如Ras和MAPK信号通路)中显著富集。
5. FANCI的功能研究
图5: A. In vitro功能实验表明,FANCI缺失显著抑制了PC-9细胞的增殖存活;B. In vitro功能实验表明,FANCI确实显著抑制了PC-9细胞的迁移和侵袭能力;C. In vivo小鼠异种移植瘤研究表明,FANCI沉默限制了PC-9细胞在体内形成肿瘤的能力。
研究意义
本研究全面分析了LUAD肿瘤微环境(TME)中的R-loop分布模式,利用单细胞测序数据构建了R-loop评分模型,分析了R-loop评分与TME和治疗反应之间的关系,发现了R-loop评分低的情况下,T细胞耗竭、免疫逃逸、代谢重编程介导的药物耐受这些生物学过程都有显著激活,最终导致肿瘤进展加速。作者通过康成生物|数谱生物R-loop DRIP-seq检测了LUAD细胞中R-loop调控因子FANCI敲低前后的R-loop分布变化,验证了R-loop与癌症进展的密切相关。这项研究清晰地展示了R-loop的异常形成在癌症发展中的前因后果,诱导R-loop异常发生的原因及其产生的严重后果对于设计肿瘤的个性化治疗至关重要,并将指导在R-loop或R-loop调控因子的基础上开发更有效的LUAD临床治疗方案。
原文出处
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-023-01924-6
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