环状RNA绝对定量RT-PCR

  • 简介
  • 服务流程
  • circRNA是目前生命科学领域新兴的研究热点分子之一。区别于传统的线性RNA,circRNA具有独特的闭合环状结构,使得其对核酸酶不敏感,所以比线性RNA更为稳定,非常适合作为临床诊断标志物(biomarker)。近期研究表明,circRNA主要通过吸附miRNA抑制后者对相应靶基因的调控,称之为竞争性内源RNA(ceRNA),而与疾病相关联miRNA的相互作用说明circRNA对疾病的调控起着非常重要的功能。实时荧光定量PCR技术是在普通PCR反应体系中加入荧光试剂,利用荧光信号实时检测PCR进程,避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,提高实验的重复性。绝对定量的实时荧光定量PCR是在实时荧光定量PCR时加入标准品通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。


    康成生物丨数谱生物为您提供环状RNA绝对定量实时定量PCR技术服务,您只需要提供保存完好的组织或细胞标本,本公司专业的技术服务人员就可替您完成绝对定量的实时定量PCR实验操作和数据分析,提供给您完整的实验报告。

    每微克 total RNA target 1 RNA拷贝数=X/3

    如果细胞的数量为106,总RNA为15ug,则每个细胞的target 1的拷贝数为:[X×15/3]/ 106

  • 1. 引物设计、合成

    设计并合成目的基因的特异性PCR引物。

    2. 样品RNA抽提

    a. 若实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),匀浆后抽提RNA。

    b. 若实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。

    3. RNA质量检测

    a.紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值,获得RNA的浓度并通过A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。

    b.甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。

    注:用于实时定量PCR检测的RNA样品,必须高纯度、完整,没有RNase 污染(降解的样品不能用于实时定量PCR检测),同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。

    4. 逆转录合成cDNA

    每个样品我们加入已知浓度的RNA(RNA Spike-in)并使用rtStar™ First-Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# AS-FS-001, Arraystar) 试剂盒进行反转录,合成cDNA第一链。

    5. 实时定量PCR

    在合成cDNA第一链中加入标准品与cDNA一同作为模板进行实时定量PCR扩增,,根据Ct值制备标准曲线。

    6. 分析结果、提供实验报告

    各样品的目的基因和标准品分别进行Realtime PCR反应。根据标准品绘制标准曲线,各样品目的基因和RNA Spike in的cDNA拷贝数结果直接由机器生成。(每个样品的目的基因cDNA拷贝数x RNA Spike in的RNA拷贝数)除以RNA Spike in的cDNA拷贝数,即为此样品此基因的校正后的RNA拷贝数。