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单细胞测序技术服务 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 单细胞全转录组测序 |
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生物分子凝聚体研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 CoIP-MS/AP-MS |
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NGS测序技术服务 DRIPc-seq |
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NGS测序技术服务 环状DNA测序 |
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基因芯片技术服务 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表观转录组学测序服务 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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NGS测序技术服务 DNA（羟）甲基化测序（抗体法） DNA甲酰基胞嘧啶(5fc)修饰测序 DNA 5hmC 测序（化学法） 染色质免疫共沉淀测序 |
PCR技术服务 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖体-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
P小体的定义及功能机制概述
P小体（Processing bodies）是一种细胞质中包含RNA与蛋白的生物分子凝聚体，其经典功能为降解mRNA，通常被认为是细胞中的“垃圾处理中心”，此外近年也有报道P小体的非经典功能，包括影响外泌体的miRNA选择装载等[1]。P小体可以通过液液相分离（Liquid-liquid phase separation，简称相变）的方式形成并富集特定的RNA和蛋白质，其中一些蛋白如DDX6、DCP1等可以作为标志物来定位细胞中存在的P小体[2]。P小体功能异常与多种疾病的发生密切相关，例如癌症、神经退行性疾病等[3]。
miRNA能够与Ago等蛋白结合，在细胞中形成RISC沉默复合物，进而特异性降解与miRNA序列互补的mRNA，有研究表明P小体中的环境对于RISC的功能有重要影响[4]。此外，由于tsRNA（tRNA derived small RNA）也可以结合Ago蛋白发挥类miRNA功能，因此tsRNA也可能与P小体有关，这方面目前研究较少，具有深入挖掘的潜力。
文章案例简介
美国Scripps研究所Ian J. MacRae教授长期致力于RNA干扰研究，在Science、Cell等顶级刊物均发表过研究论文，本文介绍的是该课题组近年在Cell上发表的一篇文章，题目为“Phase Transitions in the Assembly and Function of Human miRISC”。
文章首先利用体外实验证明Ago2与TNRC6蛋白之间存在相互作用并促进TNRC6发生相变；体内实验发现，在293细胞中也存在Ago2与TNRC6通过液液相分离形成的液滴且与P小体有联系。进一步研究发现，在Ago蛋白与miRNA结合的情况下，只有能被miRNA识别的mRNA才能进入到Ago-miRNA-TNRC6形成的相分离液滴中并发生降解，且降解的程度与相分离程度成正比。
这一结果提示我们，P小体作为细胞中降解mRNA的场所，其降解mRNA是存在选择性的，我们可以通过HYPRO-MS/芯片/seq的实验技术，定位到空间上与miRNA或者tsRNA临近的互作蛋白或者mRNA，一方面借助P小体特异的marker蛋白分析我们研究的miRNA / tsRNA分子是否能够定位于P小体，从而确定它们具有降解mRNA的作用机制。另一方面通过对临近mRNA的检测可以更准确的定位到受到这些miRNA/tsRNA调控的mRNA。
文章结果展示
1.P小体中Ago2与TNRC6聚集发生相变
图1.体外实验中，在25度时，单独Ago2或ABD（TNRC6的ago结合结构域）均不能发生有效相变，而将二者混合后（ABD+Ago2）则能发生相变。（A）293细胞中进行荧光漂变实验（FRAP）发现，P小体能够与细胞质发生动态物质交换，表明该区域发生相变。箭头标识处为P小体，绿色荧光标记的是TNRC6。（B）
2.与P小体相关的Ago-TNRC6生物分子凝聚体通过miRNA选择性招募并降解mRNA
图2. 只有当miRNA let7与Ago2结合进入生物分子凝聚体时才能凝聚体内部鉴定到let7靶RNA（8X let7 target RNA）的存在，同样条件下用miR122代替let7则不能招募let7靶RNA。沉淀为进入生物分子凝聚体的组分，上清为未进入生物分子凝聚体的组分。（A）Northern blot实验表明，当let7进入生物分子凝聚体后，能够导致同样进入的let7靶RNA长度从A114降低到A0，表明let7通过组装形成RISC沉默复合物导致靶RNA降解。（B）
3.与P小体相关的Ago-TNRC6生物分子凝聚体能够促进miRNA降解靶RNA
推荐P小体与Small RNA研究思路
根据文章结果的启发，我们首先可以通过Arraystar Small RNA芯片筛选找到差异miRNA / tsRNA，并且通过敲低/过表达研究这些差异small RNA在细胞及动物模型上对于疾病表型的影响。后续机制层面的研究，由于miRNA / tsRNA在细胞中可能关联到不同的生物分子凝聚体并发挥不同功能，因此可以采用HyPro临近标记实验找到与miRNA / tsRNA空间上临近的蛋白，通过对其中的marker蛋白进行鉴定从而选择后续生物分子凝聚体的研究方向。例如tsRNA可能关联到之前我们介绍的压力应激颗粒[5]，也可能关联到此次介绍的P小体。如果通过HyPro临近标记实验发现tsRNA和P小体相关，后续可以考虑通过FISH / IF的定位实验进行二者共定位的验证，利用HyPro-seq/芯片得到与tsRNA互作的mRNA，进一步采用Ago-APP / luciferase等实验证实tsRNA对于mRNA的降解作用。
参考文献：
[1] Liu XM, Ma L, Schekman R. Elife. 2021. PMID: 34766549
[2] Hubstenberger A, et al. Mol Cell. 2017. PMID: 28965817.
[3] Hallacli E, et al. Cell. 2022. PMID: 35688132.
[4] Iwakawa HO, et al. Mol Cell. 2022. PMID: 34942118.
[5] Emara MM, et al. J Biol Chem. 2010. PMID: 20129916.
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Ago-app RNA qPCR实验
