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单细胞测序技术服务 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 单细胞全转录组测序 |
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生物分子凝聚体研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 CoIP-MS/AP-MS |
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NGS测序技术服务 DRIPc-seq |
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NGS测序技术服务 环状DNA测序 |
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基因芯片技术服务 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表观转录组学测序服务 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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NGS测序技术服务 DNA（羟）甲基化测序（抗体法） DNA甲酰基胞嘧啶(5fc)修饰测序 DNA 5hmC 测序（化学法） 染色质免疫共沉淀测序 |
PCR技术服务 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖体-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
近期，哈尔滨医科大学附属第二医院孙亚男教授发表名为“RBM15 facilitates laryngeal squamous cell carcinoma progression by regulating TMBIM6 stability through IGF2BP3 dependent”的研究性论文。该论文应用Arraystar Human m6A mRNA & lncRNA表观转录组芯片发现，RBM15通过对TMBIM6进行m6A修饰，使TMBIM6的mRNA稳定性上升，最终促进喉鳞状细胞癌的发生发展。该研究成果于2021年2月发表在国际著名学术期刊《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》（IF: 7.1）上。（m6A表观转录组芯片由康成生物丨数谱生物提供技术服务）
研究背景
作为目前的热门研究领域之一，RNA的表观修饰吸引了大量研究者的目光，在这一领域中，m6A修饰是研究最多的一类。这一修饰的特征是在核糖核苷酸的A碱基上添加一个甲基基团，进而影响对应RNA分子的功能。已知和m6A修饰相关的蛋白主要可以分为三类，首先，writer蛋白负责将修饰添加到RNA分子上，这类蛋白包括Mettl3、RBM15等。其次，eraser蛋白负责将修饰从RNA分子上去除，主要包括ALKBH5、FTO等蛋白。最后，reader蛋白能够识别RNA分子上的m6A修饰，进一步与该分子结合后发挥相应的调控功能，例如IGF2BP家族蛋白使得RNA分子更加稳定，YHTDF1促进mRNA翻译等等。
喉鳞状细胞癌作为一类常见的恶性肿瘤，每年可造成我国约三万人患病。其主要症状包括咳血，咳痰，颈部淋巴结转移等。关于喉鳞状细胞癌的治疗，目前虽然发展了多种治疗方法，但这些方法对于患者五年期生存率并没有显著的改善。因此，开发新的有效治疗方法，提高患者的生存率便显得尤为重要。
本次研究系统地探讨了m6A修饰在喉鳞状细胞癌中的作用，发现了喉鳞状细胞癌中与m6A修饰相关的一系列蛋白以及其作用机制，对于后续相关疾病的治疗，开发新型治疗方法具有重要的参考价值和指导意义。
研究思路
预实验发现RBM15与喉鳞状细胞癌相关
为了研究影响喉鳞状细胞癌（LSCC）发生发展的相关因素。作者首先检测了LSCC患者的癌组织以及癌旁组织，发现在癌组织中m6A水平有显著上调。据此，作者通过PCR等实验找到了在癌组织中显著上调的m6A修饰酶基因RBM15。随后，作者在细胞以及小鼠模型中过表达或敲低RBM15，发现RBM15能够显著促进肿瘤的生长。
Arraystar Human m6A mRNA & lncRNA表观转录组芯片筛选
由于m6A修饰主要通过影响下游的靶基因来发挥功能，在已有文献里面这部分内容也是大家讨论的重点部分。因此作者接下来就采用了Arraystar Human m6A mRNA & lncRNA表观转录组芯片对下游的靶基因进行筛选。通过比较野生型LSCC细胞与敲低RBM15的LSCC细胞间的差异m6A修饰基因，作者找到了TMBIM6。通过MeRIP-PCR等实验，作者发现RBM15能够提高TMBIM6的m6A修饰水平，并且RBM15也可以提高TMBIM6的mRNA水平，表明RBM15可能通过调控TMBIM6的表达水平来发挥功能。
TMBIM6功能研究
为了进一步确定TMBIM6在LSCC发生发展中的作用，作者研究了TMBIM6的功能。通过transwell小室等实验，作者发现TMBIM6能够促进LSCC细胞的侵袭能力。在小鼠层面的研究则发现TMBIM6能够促进肿瘤的产生，说明TMBIM6与LSCC的发生发展具有密切关系。
机制研究
为了研究TMBIM6下游的reader蛋白，首先作者根据文章前半部分的工作，发现m6A修饰酶RBM15的敲低与TMBIM6的mRNA水平下降可能相关。而已有文献表明，与m6A修饰相关的reader蛋白中，IGF2BPs家族蛋白能够提高mRNA的稳定性。据此，作者通过检测表达水平的变化最终找到了IGF2BP3。接下来作者通过RIP等实验发现，m6A修饰的TMBIM6能够与IGF2BP3结合，过表达IGF2BP3则能够提高TMBIM6的mRNA稳定性，导致相应mRNA表达量上升。随后通过MazF PCR等实验验证了TMBIM6上m6A修饰位点的存在（GGACA），将该修饰位点突变之后，IGF2BP3就不能发挥相应的功能，表明IGF2BP3提高TMBIM6的mRNA稳定性的功能依赖于该修饰位点。最后，功能研究表明，IGF2BP3也具有类似的促癌效果，进一步证实了m6A对于喉鳞状细胞癌的促进作用。
技术路线
结果展示
图1. 预实验发现RBM15与喉鳞状细胞癌相关
A：LSCC癌组织中m6A总量高于癌旁组织。B：PCR实验发现LSCC癌组织中RBM15表达量高于癌旁组织。C：小鼠成瘤实验表明，敲低RBM15抑制肿瘤生长。
图2. Arraystar Human m6A mRNA & lncRNA表观转录组芯片筛选
A：敲低RBM15前后差异m6A修饰表观转录组芯片结果聚类图（实验组与对照组各3个样本）。B：四象限图展示在实验组与对照组的比较中，m6A修饰量以及转录本表达量均有变化的mRNA。C：MeRIP-PCR实验发现，在LSCC的细胞系中TMBIM6被m6A修饰，同时过表达RBM15能够进一步提高TMBIM6的m6A修饰水平。D：PCR实验发现，相比于野生型细胞，敲低RBM15的细胞中TMBIM6表达量更低。
图3. TMBIM6功能研究
A：Transwell小室实验发现TMBIM6能够促进癌细胞的迁移和侵袭。B：小鼠成瘤实验表明TMBIM6能够促进肿瘤生长。
图4. 机制研究
A：RIP-PCR实验发现IGF2BP3能够与TMBIM6结合，敲低RBM15会抑制它们的结合。B：PCR实验表明，过表达IGF2BP3能够导致TMBIM6的mRNA水平升高。C：利用MazF PCR验证，找到TMBIM6的m6A修饰位点（GGACA），并据此设计位点突变实验。D：双荧光素酶实验发现IGF2BP3促进TMBIM6的mRNA稳定性的功能依赖于MazF PCR检测到的m6A修饰位点。E：Transwell小室实验表明，IGF2BP3敲低会抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭。
研究意义：
在发现RBM15调控喉鳞状细胞癌内的m6A水平后，作者通过Arraystar Human m6A mRNA & lncRNA表观转录组芯片进行筛选，找到了受RBM15调控的靶基因TMBIM6。功能研究发现，TMBIM6在细胞和小鼠层面上都能够促进癌症的发生发展。进一步的机制研究表明，TMBIM6的m6A修饰能够帮助招募IGF2BP3，并且作者通过MazF PCR等实验在单碱基水平上鉴定出影响二者结合的m6A修饰位点。IGF2BP3能够提高TMBIM6的mRNA稳定性，促进TMBIM6的表达，从而促进癌症的发生发展。总体而言，这项工作思路清晰，数据详实，具有很高的科研价值与应用价值，为喉鳞状细胞癌的治疗提供了新的思路与方法。
文章链接：
https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-021-01871-4
相关技术服务
Arraystar m6A-mRNA&lncRNA表观转录组芯片
