m6A绝对定量RT-PCR技术服务

  • 简介
  • 服务流程
  • N6-甲基腺嘌呤(m6A)是RNA中丰度最高的转录后修饰,在生物学过程中扮演重要角色。很多研究发现,各类RNA上单个m6A即可发挥重要功能。由于缺乏在精确位点鉴定m6A修饰的高灵敏度方法,使得m6A的功能研究很大程度上仍未得到探索。新研究发现,T3 DNA连接酶对m6A修饰有高度的敏感性。在此基础上,我们建立了一种超灵敏的绝对定量的实时荧光定量PCR定量分析方法,可以在单核苷酸分辨率水平上准确检测RNAm6A修饰位点, 并对未知模板进行定量分析。该方法可成功地应用于实际生物样品中m6A修饰的精确检测,即使是低丰度RNA的样本。


    数谱生物(Aksomics)为您提供绝对定量实时定量PCR技术服务,您只需要提供保存完好的组织或细胞标本,本公司专业的技术服务人员就可替您完成绝对定量的实时定量PCR实验操作和数据分析,提供给您完整的实验报告,为您节省大量的时间和精力。


              每微克 total RNA target 1 RNA拷贝数=X

    如果知道细胞的数量为106,总RNA15ug,则每个细胞的target 1的拷贝数为:(X×15/ 106

      

  • 1. 引物设计、合成
    设计并合成目的分子的特异性探针
    2. 样品RNA抽提
    a. 若实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1mlRNA抽提试剂TrizolInvitrogen),匀浆后抽提RNA
    b. 若实验对象为细胞样品,每份样品取1×1061×107细胞,完全吸去培养液后加1mlRNA抽提试剂TrizolInvitrogen),裂解后抽提RNA
    3. RNA质量检测
    a.紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm280nm的吸收值,获得RNA的浓度并通过A260/280A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。

    b.甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。
    注:用于实时定量PCR检测的RNA样品,必须高纯度、完整,没有RNase 污染(降解的样品不能用于实时定量PCR检测),同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。
    4. 连接反应
    每个样品我们加入已知浓度的RNARNA Spike-in,使用连接酶连接特异性探针。

    5. 实时定量PCR
    连接反应后在管中加入标准品与连接产物一同作为模板进行实时定量PCR扩增,,根据Ct值制备标准曲线。

    6. 分析结果、提供实验报告
    各样品的目的基因和标准品分别进行Realtime PCR反应。根据标准品绘制标准曲线,各样品目的基因cDNA浓度目的基因位点m6A甲基化cDNA浓度和RNA Spike incDNA浓度结果直接由机器生成。【(每个样品的目的基因cDNA浓度-目的基因位点m6A甲基化cDNA浓度x RNA Spike inRNA浓度除以RNA Spike incDNA浓度浓度,即为此样品此目的基因位点m6A甲基化校正后的RNA含量。