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单细胞测序技术服务 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 单细胞全转录组测序 |
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生物分子凝聚体研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 CoIP-MS/AP-MS |
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NGS测序技术服务 DRIPc-seq |
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NGS测序技术服务 环状DNA测序 |
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基因芯片技术服务 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表观转录组学测序服务 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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NGS测序技术服务 DNA（羟）甲基化测序（抗体法） DNA甲酰基胞嘧啶(5fc)修饰测序 DNA 5hmC 测序（化学法） 染色质免疫共沉淀测序 |
PCR技术服务 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖体-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
中山大学孙逸仙纪念医院姚婷婷教授长期从事宫颈癌相关研究。课题组采用Arraystar circRNA芯片筛选发现环状RNA分子CDR1as在TGF-β诱导的宫颈癌细胞中显著上调。实验结果显示，CDR1as过表达显著促进肿瘤细胞迁移和侵袭、促进肿瘤组织生长，大样本验证显示CDR1as能够作为生物标志物预测宫颈癌转移患者预后情况；在分子机制方面，作者发现CDR1as通过结合IGF2BP1蛋白增加转录因子Slug的mRNA稳定性和表达水平，从而促进宫颈癌的转移。这些发现表明，TGF-β信号传导可能通过CDR1as促进宫颈癌转移，为宫颈癌治疗提供了潜在的靶点。
该研究成果于2023年发表在学术期刊Molecular Cancer上，影响因子为41.444（Arraystar circRNA芯片由康成生物|数谱生物提供技术服务）。
研究背景
TGF-β是一种多功能细胞因子，与各种癌细胞的癌症转移有关，其中包括全球女性癌症发病率和死亡率极高的宫颈癌。尽管在其他多种肿瘤中TGF-β诱导的癌细胞转移得到了深入的研究，但在宫颈癌中涉及的机制尚不完全清楚。环状RNA是由pre-mRNA经过反向剪切形成的共价闭合单链RNA，对RNA外切酶不敏感，具有稳定性高的特点。已有研究表明，circRNA可以通过结合蛋白发挥各种调控功能。目前有越来越多的研究发现，circRNA在肿瘤的发生发展中扮演重要的角色。因此，本文重点关注了circRNA在TGF-β信号通路中的参与以及在宫颈癌转移过程中的作用机制，为开发相应治疗方案提供了可靠的机制研究基础。
研究思路
文章着重于研究TGF-β信号通路对宫颈癌在转移阶段CDR1as表达和活性的调控机制。作者运用Arraystar circRNA芯片技术检测发现在TGF-β过表达的宫颈癌细胞中CDR1as显著上调。进一步应用原位杂交检测其与淋巴结转移的相关性，结果表明CDR1as表达与淋巴结转移呈正相关并预示较差的生存期。在体内外实验中，作者证明了CDR1as的过表达能够促进宫颈癌的转移，并发现CDR1as能够增强IGF2BP1对SLUG mRNA调控的功能。同时，CDR1as通过激活TGF-β信号通路聚焦于下游的效应基因SLUG，促进EMT过程。以上结果表明CDR1as在宫颈癌转移中扮演了重要的角色。
功能研究发现，在肿瘤细胞转移侵袭实验以及划痕愈合实验中，过表达CDR1as可以促进Siha细胞的转移和侵袭、加速细胞划痕的愈合；在裸鼠体内进行皮下肿瘤注射模型实验发现，CDR1as过表达导致肿瘤体积增大；另外，作者还通过K-M曲线验证了CDR1as的高表达与宫颈癌淋巴结转移和预后不良有关，能够作为诊断和预测宫颈癌转移患者预后情况的生物标志物。
机制研究发现，过表达CDR1as引起SLUG基因mRNA和蛋白质表达水平上升。在这个过程中，作者利用RNA Pull down和RIP-PCR等实验发现CDR1as与m6A识别蛋白IGF2BP1结合。另外，在CDR1as过表达细胞中沉默IGF2BP1导致下游效应基因SLUG表达降低、细胞迁移能力减弱，进一步RIP-PCR实验证实IGF2BP1能够识别和结合下游效应基因SLUG的mRNA的m6A修饰位点，维持mRNA的稳定性。总之，这些结果表明在TGF-β诱导的宫颈癌迁移模型中，预后诊断标志物CDR1as的上调通过结合IGF2BP1蛋白来稳定SLUG基因的mRNA，促进宫颈癌的转移和恶化过程。
技术路线
结果展示
图1：CDR1as在TGF-β过表达的宫颈癌细胞显著上调。
A Arraystar circRNA芯片热图显示TGF-β过表达与对照组细胞的表达差异；
B qRT-PCR验证CDR1as是在过表达组与对照组中差异最显著的分子。
图2：功能研究1，验证CDR1as表达水平对细胞迁移的影响。
A 过表达CDR1as增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力；
B, C 划痕实验证明过表达CDR1as增强肿瘤细胞Siha的迁移能力；
D 裸鼠皮下肿瘤注射实验证明CDR1as过表达导致肿瘤体积增大。
图3：功能研究2，K-M曲线显示CDR1as可作为宫颈癌转移和预后的生物标志物。
图4：机制研究1，CDR1as结合IGF2BP1蛋白并影响下游SLUG基因的表达水平。
A 过表达CDR1as引起SLUG基因蛋白质表达水平上升；
B 过表达CDR1as引起SLUG基因mRNA表达水平上升；
C RNA Pull down（上）和RIP-PCR（下）验证CDR1as与m6A识别蛋白 IGF2BP1结合；
D在CDR1as过表达细胞中沉默IGF2BP1导致下游效应基因SLUG表达降低；
E 在CDR1as过表达细胞中沉默IGF2BP1导致细胞迁移能力减弱。
图5：机制研究2，IGF2BP1蛋白结合SLUG mRNA。
A IGF2BP1蛋白RIP-PCR验证IGF2BP1结合SLUG mRNA；
B MeRIP-PCR验证SLUG mRNA在IGF2BP1结合位点有m6A修饰。
图6：作用机制图。
在以TGF-β高表达为标志的宫颈癌转移期，环状RNA分子CDR1as在肿瘤细胞中表达显著升高，并与m6A reader蛋白IGF2BP1结合，进一步介导其与下游基因SLUG的mRNA m6A修饰位点结合，增加mRNA的稳定性，使其避免被降解，使SLUG基因在mRNA和蛋白质水平表达显著上调。最终引起肿瘤细胞迁移和侵袭能力提高、肿瘤组织转移。
研究意义
本研究使用Arraystar circRNA芯片在TGF-β诱导的宫颈癌细胞中筛选，发现环状RNA分子CDR1as显著上调。可作为生物标志物预测宫颈癌转移患者预后情况，对宫颈癌转移的诊断和治疗具有良好的理论价值。在实验结果中，作者通过一系列实验表明CDR1as通过结合IGF2BP1蛋白和进一步结合SLUG mRNA的m6A修饰位点，增加该转录因子的mRNA稳定性，从而上调表达水平并最终促进宫颈癌的转移。这些发现深入研究了环状RNA分子CDR1as在TGF-β信号传导通路中的作用，并为宫颈癌治疗提供了潜在的靶点。
原文出处
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-023-01743-9
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RIP-PCR
