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蛋白表达定量 Label free非标定量 TMT标记定量 PRM靶向定量 |
宁波大学医学院龚朝辉教授团队主要从事肿瘤分子生物学研究。今年，该研究团队应用Arraystar lncRNA芯片筛选发现了一个在肺癌中异常上调的lncRNA——JPX，该lncRNA分子通过与miR-33a-5p结合而充当Twist1的ceRNA，影响肿瘤的大小、TNM分期和肺癌的转移。进一步深入研究表明，JPX是通过调节miR-33a-5p/Twist1，参与了Wnt/β-catenin信号的激活，进而促进了EMT过程，最终影响了肺癌的发生发展。该研究提示JPX/miR-33a-5p/Twist1轴可能具有治疗肺癌的潜力，具有作为药物作用靶点的潜力。该研究成果发表在Molecular Cancer上(IF：15.302)上。（芯片实验由康成生物丨数谱生物提供技术服务）
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肺癌是最恶性的癌症之一，其5年生存率根据阶段和地区差异在4％至17％之间变化。尽管近年来在肺癌的诊断和治疗方面已经取得了许多进展，但是晚期肺癌的转移仍然是导致高死亡率的主要原因。因此，需要阐明新的致癌途径，精确靶向治疗肺癌。
长非编码RNA（lncRNA）是一类长于200个核苷酸的RNA分子，对癌症的发生、发展有重要影响。异常表达的lncRNA与各种类型的癌症的发生和发展有关，在lncRNA-miRNA-mRNA调控网络中，lncRNA充当特定mRNA的竞争性内源RNA（ceRNA），调节靶基因，影响基因表达。然而，肺癌中异常表达的lncRNA的功能和机制尚不清楚。
Twist1是一种重要的转录因子，可介导上皮-间质转化（EMT）进展和肿瘤转移。此外，Wnt/β-catenin信号传导是EMT和癌症转移的关键驱动因素。作者以前的研究表明，miR-33a-5p负调控Twist1，从而抑制了非小细胞肺癌（NSCLC）的侵袭和转移，miR-33a-5p可以作为早期肺癌诊断的潜在生物标志物。
因此，作者考虑lncRNA是否可以与miR-33a-5p和Twist1形成ceRNA网络以参与肺癌的EMTs和恶性发展过程。
技术路线
研究思路
LncRNA高通量筛选及PCR验证
为了筛选到影响肺癌患者疾病进程的lncRNA分子，作者选择了4对人类肺癌组织和癌旁组织样本，应用Arraystar Human LncRNA芯片筛选差异表达的lncRNA，共筛选出1551个差异表达的lncRNA，其中817个lncRNA表达上调，734个lncRNA表达下调（图1A）。
接下来，使用miRNA-lncRNA相互作用数据库Starbase预测可能与miR-33a-5p相互作用的lncRNA。结果显示61个lncRNA存在miR-33a-5p结合位点。这61个lncRNA与1551个差异表达的lncRNA取交集后发现，lncRNA JPX既在肿瘤样本中表达量出现异常升高，又通过互补碱基对的七个连续配对与miR-33a-5p相互作用（图1B）。
RT-qPCR检测116对肺癌组织和癌旁组织中的JPX表达量，结果显示肺癌组织中的JPX表达明显高于癌旁组织（图1C）。回归分析表明，116例肺癌患者中，JPX的表达与肿瘤大小和TNM分期密切相关（图1D）。
图1. Arraystar Human lncRNA芯片筛选结果及验证
A. 四对肺癌组织和癌旁组织的差异表达的lncRNA。
B. 红色表示肺癌中表达量上调的lncRNA，绿色表示表达量下调的lncRNA。蓝色表示StarBase数据库预测可能和miR-33a-5p有结合的lncRNA数据集。结果的重叠处为lncRNA JPX。
C. RT-qPCR检测到116个配对的肺癌相对于癌旁组织JPX相对表达量上调。
D. RT-qPCR分析四种肺癌细胞系（SPC-A-1，LTEP-a-2，A549，NCI-H1299）相对正常肺上皮细胞系（BEAS-2B）中JPX相对表达量上调
为了研究JPX的生物学功能，使用重组质粒提高JPX在肺癌细胞系中表达，使用siRNA特异性敲低JPX在肺癌细胞系中表达。结果表明，JPX体外过表达促进了肺癌细胞的生长和增殖（图2A，2B，2C），而JPX敲低则抑制了肺癌细胞的生长和增殖。另一方面，利用伤口愈合实验和Transwell分析实验，检测JPX对肺癌细胞迁移和侵袭的影响。结果表明，JPX小鼠体内过表达可以增强肺癌细胞的迁移和侵袭（图2D），而JPX敲低则抑制了肺癌细胞的迁移和侵袭。
图2. JPX体外过表达促进肺癌细胞的生长和增殖，增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力
A. 进行CCK-8检测，分析JPX过表达后肺癌细胞的生存力增强。
B. 集落形成分析法检测JPX过表达后肺癌细胞的增殖能力增强。
C. 裸鼠种植稳定表达JPX的NCI-H1299细胞后，肿瘤生长能力增强。
D. 通过Transwell法检测到JPX过表达后细胞的侵袭能力增强。
机制研究
为了揭示JPX和miR-33a-5p协同调控肺癌进程的生物学机制，首先利用核质分离实验（Nuclear-cytoplasmic fractionation）得到JPX主要定位在肝癌细胞的细胞质中，进一步利用双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporters assay）、RT-qPCR、Pearson相关分析，表明JPX发挥ceRNA调控机制，在肺癌细胞中发挥mir-33a-5p海绵的功能，通过靶向结合miR-33a-5p间接调控靶基因（图3A，3B）。体外细胞水平回补JPX的实验结果表明JPX通过调控miR-33a-5p，促进肺癌细胞增殖，迁移和侵袭的能力（图3C，3D）。
图3. JPX发挥ceRNA调控机制，在肺癌细胞中作为海绵，靶向结合miR-33a-5p
A. 在miR-33a-5p共转染的细胞中，突变的（MUT）JPX报告质粒的相对荧光素酶活性明显高于野生型（WT）质粒。
B. RT-qPCR检测到敲除JPX后miR-33a-5p相对表达量上调。
C. 通过伤口愈合实验检测JPX过表达对miR-33a-5p介导的细胞迁移抑制的回补效应。
D. 通过Transwell检测到JPX过表达对miR-33a-5p介导的细胞侵袭抑制的回补效应。
由于已知研究表明miR-33a-5p负调控其靶基因Twist1，作者进一步研究JPX和Twist1在肺癌中的关系。对95对肺癌组织和癌旁组织样本检测的结果表明，Twist1在肺癌组织中高表达。Pearson相关分析表明，在肺癌患者中，JPX表达与Twist1正相关（图4A）。在肿瘤模型小鼠中，RT-qPCR显示，JPX表达在肿瘤组织中显著上调。JPX过表达诱导肿瘤组织中，Twist1在RNA和蛋白质层面（图4B）表达均增加。总体而言，数据表明JPX和Twist1在肺癌进程中协同上调。
另一方面，已知Wnt/β-catenin信号通路是EMT的驱动器，通过蛋白免疫印迹研究表明，JPX通过调节miR-33a-5p/Twist1，激活Wnt/β-catenin信号传导，介导的EMT进程（图4C，4D）。
图4. JPX/miR-33a-5p/Twist1通过激活Wnt/β-catenin途径促进肺癌细胞的EMT进展
A. RT-qPCR检测Twist1在JPX表达量高的临床样本中的相对表达量上调。
B. 蛋白免疫印迹检测到过表达JPX的SPC-A-1和NCI-H1299细胞系中，Ecadherin，N-cadherin，Vimentin，Twist1，GSK-3β和β-catenin的表达量。
C. 蛋白免疫印迹检测si-CTNNB1+pcDNA3.1-JPX转染后SPC-A-1细胞中β-catenin，E-cadherin和N-cadherin的表达量。
D. 蛋白免疫印迹检测si-Twist1+pcDNA3.1-JPX转染后的SPC-A-1细胞中GSK-3β和β-catenin的表达量。
总结全文，研究结果表明，JPX/miRNA-33a-5p/Twist1轴可作为新的ceRNA调控网络，通过激活Wnt/β-catenin信号通路参与EMT过程，从而加速了肺癌的恶性进程。这些研究结果提示，JPX可以作为潜在的治疗靶标和精准诊断和治疗肺癌的新型生物标志物。
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-020-1133-9
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