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单细胞测序技术服务 靶向单细胞测序（lncRNA&mRNA） 单细胞测序 |
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核糖体-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC-seq |
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蛋白表达定量 Label free非标定量 TMT标记定量 PRM靶向定量 |
近期，复旦大学附属中山医院殷欣老师发表名为“CircGPR137B/miR‑4739/FTO feedback loop suppresses tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma”的研究性论文。该论文应用Arraystar Human CircRNA芯片等技术发现了CircGPR137B能够通过miR-4739调控m6A去修饰酶FTO的表达，而FTO又能反回来调控CircGPR137B本身的m6A修饰，从而形成正反馈的通路，进一步下调CircGPR137B与FTO的表达，从而抑制肝细胞癌的生长。该研究成果于2022年7月发表在国际著名学术期刊《Molecular Cancer》 (IF: 41.44)上。（circRNA芯片由康成|数谱生物提供技术服务）
研究背景
肝细胞癌是全球第六大癌症，已知乙肝病毒感染，黄曲霉素的摄入等多种因素均能促进肝细胞癌的发生。对于肝细胞癌的治疗，除了常规的手术切除以及放化疗之外，最新的治疗手段包括靶向药物治疗等均具有较好的效果。然而，为了实现根治肿瘤的目的，仍需开发新的治疗方法。因此，对于影响肝细胞癌发生发展的机制研究依然具有重要的意义。
环状RNA（circRNA）是一类将线性RNA分子的3’端和5’端通过反向剪切共价连接形成的环状RNA分子，可以由外显子、内含子或者同时包含这两种序列的片段组成。与线性分子相比，这种环形的结构可提高环状RNA的稳定性。环状RNA发挥功能的机制包括结合特定的蛋白来调控靶蛋白的功能，参与ceRNA调控机制等。
m6A修饰是目前研究最多的一类RNA修饰分子。这一修饰的特征是在核糖核苷酸的A碱基上添加一个甲基基团，进而影响对应RNA分子的功能。已知和m6A修饰相关的蛋白主要可以分为三类，首先，writer蛋白负责将修饰添加到RNA分子上，这类蛋白包括mettl3、RBM15等。其次，eraser蛋白负责将修饰从RNA分子上去除，主要包括ALKBH5、FTO等蛋白。最后，reader蛋白能够识别RNA分子上的m6A修饰，进一步与该分子结合后发挥相应的调控功能，例如IGF2BP家族蛋白使得RNA分子更加稳定，YHTDF1促进mRNA翻译等等。
本次研究系统地探讨了环状RNA在肝细胞癌中的作用，提出了环状RNA通过ceRNA机制来影响细胞m6A修饰，形成正反馈通路促进肝细胞癌发生发展的新机制，对于后续相关研究具有重要的借鉴意义。
研究思路
Arraystar Human CircRNA芯片筛选
为了研究肝细胞癌（HCC）发生发展的相关机制，作者对HCC患者肿瘤组织利用Arraystar human circRNA芯片进行高通量筛选。结果发现，与癌旁组织相比，在HCC患者的肿瘤组织中，CircGPR137B出现了显著的下调。进一步在临床样本上的PCR验证也证实了这一现象的存在。利用RNase R处理后PCR结果表明，CircGPR137B的表达并未出现明显的下降，因而说明其确实存在环形的特征。最后，KM曲线分析表明CircGPR137B低表达的肿瘤预后较差。
功能研究
为了确定CircGPR137B的功能，作者在HCC细胞系中过表达/敲低了CircGPR137B，结果发现CircGPR137B能够抑制肿瘤细胞生长。随后，作者在小鼠体内也进行了类似研究，发现在体内，CircGPR137B依旧能够抑制肿瘤的生长以及转移，表明CircGPR137B具有显著的抑癌功能。
机制研究
首先，利用AGO-RIP以及双荧光素酶等实验，作者发现CircGPR137B能够结合miR-4739，进而调控m6A去甲基化酶FTO的mRNA水平变化。因此在肿瘤细胞，FTO的mRNA表达与CircGPR137B一样都呈现下调的趋势。进一步的，作者利用RIP-PCR发现，FTO蛋白能够直接与CircGPR137B结合。通过MeRIP-PCR等实验，作者发现FTO蛋白水平的下降能够增加CircGPR137B的m6A修饰水平，进而导致CircGPR137B的稳定性下降。因此，肿瘤细胞中CircGPR137B的表达水平下降能够通过下调FTO的表达，增加CircGPR137B本身的m6A修饰水平，进一步促进CircGPR137B以及FTO的表达量下调，从而形成一条促进HCC发生发展的正反馈通路。
技术路线
结果展示
图1. Arraystar Human CircRNA芯片筛选到CircGPR137B
A：聚类图展示差异circRNA的表达情况，发现CircGPR137B在HCC（肝细胞癌）中表达下调。
B：火山图展示差异circRNA的分布情况。
C：Q-PCR验证发现HCC中CircGPR137B表达下调。
D：RNase R处理后进行q-PCR检测，发现CircGPR137B表达量未出现明显下降。
E：K-M曲线分析发现，CircGPR137B低表达的肿瘤预后较差。
图2. CircGPR137B抑制肿瘤生长
A：MTT实验表明过表达CircGPR137B抑制肿瘤细胞增殖。
B：细胞迁移实验发现，过表达CircGPR137B抑制肿瘤细胞迁移。
C：小鼠成瘤实验发现，过表达CircGPR137B抑制体内肿瘤组织生长。
图3. CircGPR137B作用机制研究
A：AGO-RIP实验发现，CircGPR137B与miR-4739均能结合ago2，表明circRNA能够靶向对应的miRNA发挥功能。
B：双荧光素酶实验表明，miR-4739能够直接与FTO的mRNA 3’ UTR结合，发挥调控功能。
C：RIP实验表明，FTO蛋白能够直接与CircGPR137B结合。
D：MeRIP-PCR实验表明，FTO蛋白能够调控CircGPR137B上的m6A修饰水平。
E：敲低FTO后，CircGPR137B表达水平下降，从而形成正反馈通路调节肿瘤生长。
F：敲低CircGPR137B或者FTO均能抑制肿瘤细胞转移。
图4. CircGPR137B作用机制模型
肿瘤细胞中CircGPR137B的表达水平下降能够通过ceRNA机制影响miR-4739，进而下调FTO的表达，增加CircGPR137B本身的m6A修饰水平。这一结果会进一步促进CircGPR137B与FTO的表达量下调，从而形成一条促进HCC发生发展的正反馈通路。
研究意义
作者首先通过Arraystar Human CircRNA芯片进行筛选，利用HCC（肝细胞癌）患者组织与癌旁组织进行比较，筛选到了与HCC发生发展相关的重要环状RNA分子CircGPR137B。进一步通过细胞层面敲低以及过表达等功能实验发现，CircGPR137B能够抑制细胞增殖与迁移，小鼠层面的体内研究也获得了相同的结论。此外，作者发现CircGPR137B能够结合miR-4739，通过ceRNA机制调控m6A去甲基化酶FTO的表达。有趣的是，FTO同时还能够影响CircGPR137B的修饰水平。通过这一机制反过来调控CircGPR137B自身的表达水平，因而形成了一条正反馈通路，即肿瘤细胞中表达下降的CircGPR137B通过调控FTO的表达，倒回来使CircGPR137B自身的表达水平以及FTO的表达水平产生进一步的下调，从而影响HCC的发生发展。总体而言，这项工作思路清晰，数据详实，具有很高的科研价值与应用价值，为肿瘤的治疗提供了新的思路与方法。
文章链接
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01619-4
康成|数谱生物提供的相关服务：
Arraystar human circRNA表观转录组芯片
Ago-RIP PCR
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