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鉴定和检测体内 RNA G-四联体（rG4）是研究细胞生物学和人类疾病中 rG4功能的必要步骤。基于二代测序（NGS）的rG4检测技术，比如 G4RP-seq[1]、BG4 uvRIP-seq 或DMS-seq联合RT 停滞位点检测[2]等，已被用于研究整个转录组中的 rG4 表达情况，并评估各种条件下的定量变化。然而，这些方法在准确定量检测 rG4 上均存在一定的局限性。
在G4RP-seq 和 uvRIP-seq 中，需要对样本进行交联以保留细胞内瞬时形成的rG4结构。然而，间接的 RNA-RNA 相互作用也可能被交联，从而可能导致假阳性结果[3].
此外，在捕获 rG4 的过程中，rG4抗体或配体与 rG4 的结合可能会受到 rG4 结合蛋白（如 G3BP1 和 nucleolin）的阻碍，这些蛋白在体内优先与 rG4 结构相互作用并占据结合位点。例如，G3BP1 通过其 C 端 RGG 结构域直接与 rG4 结合，并调节 mRNA 的稳定性[4]。这些蛋白对 rG4 的占位及其交联会阻碍 rG4 抗体或小分子配体的后续结合，从而导致假阴性检测结果。
rG4芯片 vs DMS-seq 联合 RT停滞位点检测
DMS-seq 联合 RT停滞位点检测方法包含了体内 DMS 处理步骤和 RT 停滞位点分析。处于展开状态的 rG4 区域中的鸟嘌呤(G)在其 N7 位置被 DMS 甲基化，而折叠的 rG4 结构中的鸟嘌呤(G)受G4结构保护不会被 DMS 甲基化[2]。受体内 rG4 结构保护而未被 DMS 甲基化的鸟嘌呤可以在体外重新折叠成 rG4，而被甲基化的鸟嘌呤则不能，因此可以间接推断出体内 rG4 的折叠状态。
不过，DMS 同时也能在 N1 位甲基化腺苷（A）形成m1A和在 N3 位甲基化胞嘧啶（C）形成m3C（图 1）。在 DMS-seq 加RT停滞位点检测分析中，反转录酶不仅会在遇到折叠的 rG4 时停滞和链终止，也会在遇到 m1A 或 m3C 时停滞和链终止。因此，检测到的RT停滞位点既可能是折叠的 rG4 位点，也可能是 m1A 或 m3C 位点，这会导致对真正的 rG4 位点的定量不准确。
Arraystar rG4芯片平台使用 G4 特异性抗体 BG4 来亲和性捕获含有 rG4 结构的 RNA 片段，这样产生的 rG4 信号比依靠逆转录酶停滞所产生的信号更加真实。然后，通过 AlkB 处理去除所捕获 RNA 的m1A与m3C甲基化，以实现无障碍、无偏倚的反转录，并进行 cRNA合成 和 rG4芯片检测。体内 DMS 处理和体外重折叠保留并恢复了真正的原生 rG4 构象，再加上抗 G4 抗体 BG4，就能高效、特异地捕获真正的含 rG4 的 RNA 片段。最后，rG4-RNA 通过 Arraystar rG4 芯片进行检测，比测序更加灵敏。因此，Arraystar rG4芯片平台是最准确、最灵敏的体内 rG4 分析平台。
图 1 DMS-seq联合 RT停滞分析时，无论是在遇到折叠的 rG4 时，还是在遇到 DMS 甲基化的 m1A 或 m3C 时，反转录酶（RT）都会停止，cDNA 链也会终止，从而导致对 rG4 位点的错误识别。
RNA-seq无法准确定量低丰度的rG4
活细胞（体内）中 rG4 的形成情况是研究 rG4功能的必要信息。其中一个主要难点是，rG4s 在体内的折叠和展开是快速和动态的，而且其自然平衡是倾向于展开状态的。因此，细胞中含 rG4 的 RNA 数量非常少，其丰度较低，很难捕捉。
在 RNA-Seq 中，大多数测序reads来自高丰度 RNA（如管家基因），而低丰度 RNA 的覆盖率较低。低测序深度降低了检测低丰度RNA 片段的灵敏度和定量的可靠性。然而，增加测序深度并不能线性地提高低丰度转录本的灵敏度和准确性，而且随着测序深度增加到一定程度，其边际收益会迅速降低。因此，rG4-RNA 本身的低丰度水平导致基于 RNA-seq 的方法难以准确检测和量化它们。
例如，lncRNA-MALAT1 是一种因其 rG4 形成而被广泛研究的 RNA，但在通过测序（G4RP-Seq）绘制其rG4图谱时，就遇到了这一问题 [3]。G4RP-Seq 需要添加 G4 稳定配体 BRACO-19 和 RHPS4 （它们可以人为地诱导和稳定 G4），才能检测到来自 MALAT1 的显著 rG4 信号[1]。然而，这种方法并不适合在正常生理条件下观察自然的、瞬时的rG4。
图 2 G4RP-Seq中，生物素对照、未处理、BRACO-19 处理和 RHPS4 处理样本 [3] 的 MALAT1 rG4 信号。虽然用 G4 稳定配体 BRACO-19 或 RHPS4 处理会产生较高的 rG4 信号，但这些 rG4s 是人工诱导和稳定的 rG4s [1]，不能代表体内原生的瞬时 rG4 状态，也不适合观察正常生理条件下的天然 rG4s。
此外，在RNA测序中，RPKM（Reads Per Kilobase of transcript per Million reads mapped）用于对文库大小和基因长度的差异进行均一化处理。然而，RPKM 值反映的是样本中转录本的相对丰度，RNA 成分的变化会影响整个 RNA 图谱，使用 RPKM 比较不同样本的转录本表达水平可能会产生误导。在进行跨样本比较时，这些差异会扭曲 RNA 表达水平。因此，RNA-seq 的 rG4 图谱不适合用于比较不同样本间的 rG4 丰度。
而使用 rG4 芯片分析rG4时，RNA 目标与其序列特异性探针杂交，不受其他 RNA 序列的影响，甚至不受高丰度 RNA 的影响。在 RNA 测序中，高丰度 RNA（如管家基因 RNA）会挤占低丰度 RNA 的覆盖度，但它们对芯片上低丰度转录本的检测几乎没有影响。因此，基于芯片的分析平台特别适合定量检测低水平表达的 rG4-RNA。
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参考文献
1.Yang SY et al: Transcriptome-wide identification of transient RNA G-quadruplexes in human cells. Nat Commun 2018, 9(1):4730.[PMID: 30413703]
2. Guo JU, Bartel DP: RNA G-quadruplexes are globally unfolded in eukaryotic cells and depleted in bacteria. Science 2016, 353(6306).[PMID: 27708011]
3. Yang SY, Monchaud D, Wong JMY: Global mapping of RNA G-quadruplexes (G4-RNAs) using G4RP-seq. Nat Protoc 2022, 17(3):870-889.[PMID: 35140410]
4. He X, Yuan J, Wang Y: G3BP1 binds to guanine quadruplexes in mRNAs to modulate their stabilities. Nucleic Acids Res 2021, 49(19):11323-11336.[PMID: 34614161]
