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Arraystar GlycoRNA芯片
Arraystar GlycoRNA芯片结合了GlycoRNA的生物化学富集和RNA定量分析方法，利用这两种方法在特异性、灵敏度和准确性方面的优势，检测GlycoRNA的表达。
芯片涵盖了广泛的糖基化小RNA类别，包括Y-RNAs/Y-RNA片段、tRNAs、tsRNAs（tiRNAs和tRFs）、pre-miRNAs、miRNAs、snRNAs/snRNA片段、snoRNAs/snoRNA片段和rRNAs/rRNA片段。
利用这种新的方法，研究者可以获得全面的GlycoRNA表达细节，以发现和理解这类在基因调控、细胞功能和人类疾病中发挥功能的新RNA分子。
GlycoRNA检测方法
通过高度特异性的生化方法从总RNA样本中检测、捕获富集GlycoRNA，以确保得到真正的GlycoRNA信号，提高检测灵敏度。
1.代谢标记和点击化学
GlycoRNA用点击化学方法进行标记[1]（图1）。该方法利用报告糖，如叠氮-乙酰甘露胺（Ac4ManNAz）与叠氮化物基，加入到细胞或组织的聚糖中。然后将分离的RNA的聚糖偶联于叠氮化物和二苯并环辛烷-生物素（DBCO-生物素）与偶氮化物环加成点击化学（图1）。
GlycoRNA用点击化学方法进行标记[1]（图1）。该方法利用报告糖，如叠氮-乙酰甘露胺（Ac4ManNAz）与叠氮化物基，加入到细胞或组织的聚糖中。然后将分离的RNA的聚糖偶联于叠氮化物和二苯并环辛烷-生物素（DBCO-生物素）与偶氮化物环加成点击化学（图1）。
2.高碘酸盐氧化和醛连接（pAL）
高碘酸盐氧化和醛连接法（pAL）用于标记天然GlycoRNA，不需要在活细胞中进行[2]。该方法采用高碘酸盐在优化条件下选择性地将GlycoRNA的唾液酸二醇氧化成醛基，然后与醛反应生物素试剂的胺基醛连接（图2）。pAL方法稳定而又灵活，灵敏度比以往检测唾液酸化RNA的方法至少高一个数量级。
图2. 在RNA高碘酸盐氧化和醛连接（rPAL）中，唾液酸二醇可以被高碘酸盐氧化为醛，然后连接到醛反应标记的胺基上，比如生物素。
3.体内高碘酸盐氧化和醛标记（pAL）
体内高碘酸盐氧化和醛标记法（pAL）是用荧光染料或生物素标记活细胞表面（细胞膜表面）的GlycoRNA [3]。具体地说，Cy5-酰肼或生物素-酰肼可以与用高碘酸钠轻度氧化处理过的细胞表面GlycoRNA结合并做上标记。
图3. GlycoRNA中的唾液酸二醇与高碘酸盐氧化形成醛基。生物素或Cy5-酰胺通过醛基偶联到GlycoRNA上。
4.GlycoRNA的细胞表面成像
为通过唾液酸接头和RNA FISH介导的接近连接实验（aptamer and RNA in situ hybridization-mediated proximity ligation assay, ARPLA）[4]，GlycoRNA在细胞表面的表达和定位可以被直观地看到。如图4所示，ARPLA由以下功能成分组成：
(1)一个多糖探针，其中有一个“接头”选择性地结合N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac），一个“间隔子”以避免探针杂交时可能存在的空间位阻，以及一个DNA连接序列G（用于随后的接近连接）；
(2)一个RNA结合探针与RNA原位杂交“RISH”，另一个“间隔子”和一个连接序列R，与连接子G一起工作；
(3)连接子1和2与连接子G和R杂交，允许原位连接生成环状DNA作为滚环扩增的模板；
(4)由荧光基团偶联的单链DNA（ssDNA）探针组成的报告基因，以检测GlycoRNA信号。探针与RNA之间的多糖-核酸双重结合与DNA报告基因的原位连接确保了高特异性和低假阳性，同时滚环扩增可以快速产生高灵敏度的信号。
图4. 使用ARPLA进行GlycoRNA成像。(a)聚糖探针、RNA结合探针和连接子的示意图。(b) 它们与GlycoRNA同时结合，使T4 DNA连接酶发生连接，形成使用phi29 DNA聚合酶进行滚环扩增（RCA）的模板。扩增后的RCA产物通过荧光报告基因探针杂交进行检测。(c) MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231细胞中U1、U35a和Y5 GlycoRNA的ARPLA成像。
5.凝集素亲和富集
凝集素，如小麦胚芽凝集素（WGA）和小麦凝集素II（MALII），可以识别并直接结合GlycoRNA上的唾液酸化聚糖结构[1].基于生物素-凝集素亲和结合的GlycoRNA纯化是分离和富集GlycoRNA的有效方法
生物信息学工具
生信工具可以极大地帮助GlycoRNA研究。例如GlyinsRNA，可以预测RNA分子上潜在的糖基化位点[5]，使用糖基化和非糖基化的小RNA序列来训练机器学习模型[6]，并利用在线网站注释预测出来的糖基化位点和RNA结合蛋白（RBP）相关的motif序列。
功能研究
1.GlycoRNA结合蛋白
GlycoRNA结合的伴侣蛋白能够很好地指示GlycoRNA的功能。在这种相互作用中参与的蛋白质既可以结合GlycoRNA的聚糖部分（如siglecs），也可以结合RNA部分（RNA结合蛋白，RBP）。比如在GlycoRNA免疫调节潜力的研究中，可以通过免疫学分析来评估GlycoRNA与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec）受体家族成员之间的相互作用[1, 7]，通过验证和深入研究这些相互作用，研究者可以深入了解GlycoRNA如何影响免疫反应，并促进各种疾病过程，特别是神经炎症和自身免疫性疾病[1, 7]。反过来讲，GlycoRNA也有着作为许多孤儿受体（尚未发现具有配体的受体）的配体潜力。
2.遗传、药理学，酶学方法
遗传和药理抑制方法已被用于研究GlycoRNA的生物合成和功能。例如，基因ldlD突变细胞系缺乏将UDP-葡萄糖（Glc）/GlcNAc转化为UDP半乳糖的能力，CRISPR-Cas9敲除UDP-半乳糖-4-差向异构酶和聚糖生物合成药理抑制剂（如NGI-1，基芬宁辛，斯旺索宁）已被用于观察GlycoRNA在生物发生上的聚糖生物合成机制[1]。一组对聚糖结构具有不同特异性的内糖苷酶，如唾液酸酶、PNGaseF、糖苷内切酶F2/F3/Hf和O-脱糖苷酶，可用于分析聚糖结构和GlycoRNA功能[1]。这些研究为了解GlycoRNA形成的机制及其在各种细胞过程和疾病状态中的潜在作用提供了宝贵的基础。
相关服务
GlycoRNA芯片技术服务
相关综述
什么是糖基化RNA（GlycoRNA）？
为什么研究GlycoRNA？
参考文献
[1] Flynn, R.A., et al. (2021) "Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells" Cell 184(12):3109-3124 e22 [PMID:34004145]
[2] Hemberger, H., et al. (2023) "Rapid and sensitive detection of native GlycoRNAs" bioRxiv 2023.02.26.530106
[3] Abledu, J.K., et al. (2024) "Cell surface RNA expression modulates alveolar epithelial function" bioRxiv 2024.05.19.594844
[4] Ma, Y., et al. (2024) "Spatial imaging of GlycoRNA in single cells with ARPLA" Nat Biotechnol 42(4):608-616 [PMID:37217750]
[5] Cui, C., et al. (2021) "GlyinsRNA: a webserver for predicting glycosylation sites on small RNAs" RNA Biol 18(sup2):600-603 [PMID:34559595]
[6] Flynn, R.A., et al. (2019) "Mammalian Y RNAs are modified at discrete guanosine residues with N-glycans" bioRxiv 787614
[7] Zhang, N., et al. (2024) "Cell surface RNAs control neutrophil recruitment" Cell 187(4):846-860 e17 [PMID:38262409]
