服务优势
● 单碱基分辨率：断点位置即坐标，m⁷G 与 m³C 位点都落到单个核苷酸。
● 两种修饰同批读出：m⁷G 与 m³C 一起给出，两张位点表可直接比较。
● 位点级定量：断点下游第一个碱基起的 reads 占该位点覆盖的比例，给出该位点的修饰水平；部分修饰的位点保留中间值。
● 无抗体化学法：不经过免疫沉淀，化学步骤前也不做 RNA 类别分级，避免富集环节引入的偏倚。
● 覆盖多类 RNA：同一份反应读出样本中的各类 RNA；tRNA 与 rRNA 位点最完整，mRNA 与 lncRNA 位点为探索性。
● 注释完备：每个位点标注宿主转录本、RNA 类别与所在结构区域，并按亲本碱基区分两种修饰。
背景介绍
m⁷G 与 m³C 的碱基-核糖键都不稳定。m⁷G 环上的氮带正电荷，m³C 走同一条降解路线，加热加碱即足以使碱基脱离核糖，在链上留下 AP 位点。m⁷G 分布在 mRNA、rRNA、tRNA 与 miRNA 等多种 RNA 上，参与 RNA 加工、稳定性、出核与翻译；m³C 同样存在于 mRNA、tRNA 与 rRNA 中，其形成机制与功能仍在被逐步阐明。
AlkAniline-Seq 用这一性质定位修饰。苯胺在 AP 位点驱动 β-消除、切断骨架，相邻残基上留下 5′-磷酸。反应前先用磷酸酶去除 RNA 原有的 5′-磷酸，因此只有断端的新磷酸能接入接头，未修饰片段不进入文库。比对后按亲本碱基区分修饰：断在鸟苷上的记作 m⁷G；胞苷断点只在已知 m³C 位点上判作 m³C，因为 ho⁵C 具有同样的易断键，不能只凭亲本碱基判定。
方法的适用面来自同一原理。该路线已在细菌、酵母与人细胞质 / 线粒体的 tRNA 与 rRNA 上验证，总 RNA 直接进反应、不做片段选择，这些 RNA 的位点目录因此最完整；转录本层面的位点则取决于样本中该 RNA 类别的覆盖深度。
关键概念：AlkAniline-Seq 是一种化学测序方法。加热加碱使 m⁷G 或 m³C 的碱基脱落、留下 AP 位点；苯胺在该处切断骨架，并在下一个残基上生成 5′-磷酸。接头由此接入，断点位置即修饰位点。
图 1. AlkAniline-Seq 检测原理。加热加碱让 m⁷G 与 m³C 的碱基脱落、留下 AP 位点；苯胺 β-消除切断骨架，在相邻残基上留下 5′-磷酸，接头只从该处接入，断点即修饰位点，亲本碱基区分 m⁷G 与 m³C。
实验流程
图 2. AlkAniline-Seq 实验流程。
生物信息分析
比对到参考序列后，逐位点统计断端 reads 并换算成该位点的修饰水平；断在鸟苷上的位点归入 m⁷G 列表，断在胞苷上的归入 m³C 列表。分析包含位点在各 RNA 类别与结构区域上的分布、组间差异比较与基因组浏览器可视化。
交付内容
测序原始数据（FASTQ），已按 GEO/SRA 提交格式整理。
质控与比对结果：质控报告、BAM 文件与比对统计。
单碱基 m⁷G 位点表（XLSX），含坐标、宿主转录本与位点修饰水平。
单碱基 m³C 位点表（XLSX），含坐标、宿主转录本与位点修饰水平。
位点在各 RNA 类别与结构区域上的分布图（PDF/PNG）。
组间差异修饰位点表，含倍数变化与显著性。
基因组浏览器信号文件（bigWig/bedGraph）与项目结题报告。
研究应用
翻译调控：把位点级 m⁷G 变化与核糖体占据、密码子翻译效率联系起来。
miRNA 加工：读出 m⁷G 对 pri-miRNA 结构与成熟 miRNA 生成的影响。
写入酶研究：观察 METTL1/WDR4 等甲基转移酶缺失或过表达后 m⁷G 位点的变化，m³C 侧对应 METTL6 与 METTL2A/2B。
低丰度 RNA：以总 RNA 为起始材料，把 tRNA 与 rRNA 上低丰度位点一并读出。
肿瘤与疾病模型：比较肿瘤与正常组织、或敏感与耐药材料之间的位点谱。
方法交叉验证：把化学断点结果与抗体法或切割法图谱放在同一批样本上并列比较。
常见问题
为什么一条文库能读出两种修饰？
切断方式相同，掉下来的碱基不同。比对时断在鸟苷上的位点记作 m⁷G，断在胞苷上的记作 m³C，两张位点表因此来自同一次实验，而不是两次独立建库，组间比较也更直接。
m³C 在转录本层面的证据为什么仍有分歧？
因为不同化学路线给出的结论不同。抗体富集类路线曾在 mRNA 上报告富集，而切割类路线在 mRNA 与其他非编码 RNA 中未见同等水平的信号。本方法在 tRNA 与 rRNA 上给出的位点目录最完整，转录本层面的结果取决于覆盖深度。
需要先做富集或片段选择吗？
不需要。反应作用于碱基本身，与片段长短无关，总 RNA 可直接进入化学步骤；接头只从新生成的 5′-磷酸端接入，未修饰片段本身不进入文库，因此无需免疫沉淀或片段选择。
部分修饰的位点怎么报告？
报比例而不是报有或无。末端落在该位的 reads 占该位点覆盖的比例给出 0 到 1 之间的修饰水平，只在部分分子上被修饰的位点保留中间值，低修饰位点不会因阈值被直接抹掉。
和靶向转化读 m⁷G 的路线比，该怎么选？
m7G-Quant-seq 靠靶向化学转化产生的逆转录特征读 m⁷G；本方法读的是链被切断的位置，并在同一次实验里同时给出 m³C 位点。当两种标记都在研究范围内、或需要低丰度 RNA 的位点目录时，这条路线更合适。
参考文献
Marchand V, Ayadi L, Ernst FGM, et al. AlkAniline-Seq: profiling of m7G and m3C RNA modifications at single nucleotide resolution. Angewandte Chemie International Edition 2018. DOI: 10.1002/anie.201810946. PMID: 30370969
Zhang LS, Liu C, Ma H, et al. Transcriptome-wide mapping of internal N7-methylguanosine methylene in mammalian mRNA. Molecular Cell 2019. DOI: 10.1016/j.molcel.2019.03.036. PMID: 31031084
Lin S, Liu Q, Lelyveld VS, et al. Mettl1/Wdr4-mediated m7G tRNA methylome is required for normal mRNA translation and embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Molecular Cell 2018. DOI: 10.1016/j.molcel.2018.06.001. PMID: 29983320
Cui J, Sendinc E, Liu D, et al. m3C32 tRNA modification controls serine codon-biased mRNA translation, cell cycle, and DNA-damage response. Nature Communications 2024. DOI: 10.1038/s41467-024-50161-y. PMID: 38982125