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广东省人民医院胃肠外科李勇教授长期从事结直肠癌相关研究,课题组采用Arraystar circRNA芯片筛选发现,环状RNA分子circPDIA3在奥沙利铂(OXA)耐药性结直肠癌患者的肿瘤组织中显著上调。细胞和实验结果显示,敲低circPDIA3可使耐药细胞对OXA敏感,而过表达则降低了细胞对OXA的耐药性,临床研究显示circPDIA3能够作为生物标志物预测结直肠癌患者对OXA的耐药以及预后情况;在分子机制方面,作者发现circPDIA3通过直接结合细胞焦亡关键因子GSDME蛋白中的GSDME-C结构域,从而抑制细胞焦亡;并且,circPDIA3的表达还受到转录因子XBP1的调控,而circPDIA3又可以通过ceRNA海绵作用吸附miR-449a增强XBP1的表达,形成一个正反馈回路。这些发现揭示了circPDIA3在结直肠癌中的化疗耐药作用,提示circPDIA3可以作为克服结直肠癌患者OXA耐药的潜在生物标志物和治疗靶点。
该研究成果于2024年发表在学术期刊Drug Resistance Updates上,影响因子为15.8(Arraystar circRNA芯片由康成生物|数谱生物提供技术服务)。
研究背景
结直肠癌(CRC)是全球第二大常见的恶性肿瘤,化学药物奥沙利铂(OXA)被广泛应用于结直肠癌的一线治疗,但临床上常出现OXA耐药,并引起结直肠癌复发。在OXA耐药性产生的分子机制中,存在多种生物学因素与之相关,其中细胞焦亡的异常调控是近年来研究的一大重点,阐明细胞焦亡的异常调控机制对CRC治疗方案的进一步优化具有重要意义。环状RNA(circRNA)是一类共价闭合单链形式的特殊ncRNA,由pre-mRNA经过反向剪接形成,这种特殊的结构使它们对RNA外切酶不敏感,在胞内胞外的稳定性更高;有越来越多的研究发现,circRNA在各类肿瘤的耐药性产生过程中发挥关键的调控作用,可以通过结合蛋白对蛋白的功能进行激活或抑制,也可以通过竞争性内源RNA(ceRNA)机制结合miRNA,调控下游基因的表达水平。这篇文章中,作者发现环状RNA circPDIA3在体内外均可通过抑制细胞焦亡来诱导CRC细胞的OXA化疗耐药性,为circRNA调控细胞焦亡诱导细胞耐药性的机制提供了新的见解,为优化创新CRC治疗方案提供了有前景的机制研究基础。
研究思路
文章着重于研究circPDIA3与细胞焦亡对结直肠癌在OXA耐药作用产生阶段的调控机制。作者运用Arraystar circRNA芯片技术检测发现在OXA耐药的结直肠癌患者肿瘤组织中circPDIA3显著上调。进一步临床研究表明,circPDIA3表达与CRC患者的复发或转移率呈正相关,且circPDIA3高表达的患者具有较差的预后。在体内外实验中,作者证明了circPDIA3的过表达能够增强结直肠癌细胞的OXA耐药性;同时,circPDIA3能通过直接结合细胞焦亡的关键效应因子GSDME蛋白中的GSDME-C结构域,抑制细胞焦亡通路的激活。文章结果表明circPDIA3在结直肠癌OXA耐药性发生过程中扮演了重要的角色。
在功能研究中,作者发现在OXA处理CRC细胞或小鼠模型实验中,过表达circPDIA3可以促进OXA持续治疗下的肿瘤细胞生长,而抑制circPDIA3则导致肿瘤细胞被OXA诱导发生细胞焦亡,肿瘤组织体积减小;另外,作者还通过K-M曲线分析发现circPDIA3的高表达与结直肠癌复发和转移有关,能够作为诊断和预测结直肠癌患者预后情况的生物标志物。
在机制研究中,作者利用RNA Pull down-MS和RIP-PCR等实验发现circPDIA3能够直接结合GSDME-C结构域,促进GSDME-C与另一结构域GSDME-N结合,抑制GSDME-N对细胞焦亡的触发活性,作者进一步验证了circPDIA3结合GSDME-C能够抑制蛋白的棕榈酰化修饰水平,进一步放大GSDME-C对GSDME-N的结合和抑制作用。另外,作者还发现circPDIA3的过表达增加了转录因子XBP1的表达水平,生物信息学预测、RNA Pull down-MS、双荧光素酶实验、RIP-PCR等实验证明circPDIA3能够通过ceRNA机制吸附miR-449a上调XBP1的表达,而XBP1能够与PDIA3启动子结合并激活基因表达,又促进了circPDIA3的产生,形成了一个正反馈回路。总之,这些结果表明在OXA耐药的结直肠癌模型中,生物标志物circPDIA3的上调通过结合GSDME蛋白来抑制细胞焦亡,加速结直肠癌的耐药进程。
技术路线
结果展示
图1:circPDIA3在OXA耐药型的CRC患者肿瘤组织和细胞中显著上调。
A. Arraystar circRNA芯片热图显示OXA耐药型患者组织与敏感型组织的表达差异;
B. qRT-PCR验证circPDIA3在多种CRC细胞系中都有显著高表达。
图2:功能研究,验证circPDIA3表达水平对CRC细胞和组织耐药性的影响,以及circPDIA3作为生物标志物的潜力。
A. 过表达circPDIA3显著增强了肿瘤细胞在OXA处理下的增殖能力;
B. 抑制circPDIA3显著抑制了PDX模型肿瘤组织的生长能力;
C. 大样本PCR实验证明复发和转移的CRC患者组织的circPDIA3有显著更高的表达水平;
D. K-M生存曲线证明circPDIA3的表达与CRC患者的不良预后有显著相关。
图3:机制研究1,circPDIA3通过结合GSDME蛋白调控细胞焦亡。
A. RNA Pull down实验发现circPDIA3能够结合GSDME蛋白;
B. RIP-PCR验证circPDIA3与GSDME蛋白的结合;
C. 突变circPDIA3与GSDME结合的相关位点验证RNA-蛋白的结合;
D. CoIP实验证明circPDIA结合GSDME-C结构域,并且加强GSDME-C与GSDME-N的结合;
E. 敲低circPDIA3导致发生焦亡的细胞比例显著升高。
图4:机制研究2,CoIP验证circPDIA3结合GSDME-C并抑制蛋白的棕榈酰化。
图5:机制研究3,circPDIA3海绵吸附miR-449a调控XBP1表达。
A. 敲低circPDIA3显著降低了XBP1表达水平;
B. 多种生物信息学方法预测circPDIA3通过ceRNA机制结合的miRNA;
C. RNA Pull down验证circPDIA3与miR-449a的结合;
D. AGO-RIP-PCR实验验证circPDIA3与miR-449a的结合;
E. 过表达miR-449a验证miRNA对XBP1表达的下调作用和circPDIA3对XBP1表达的保护。
图6:机制研究4,XBP1结合PDIA3启动子调控circPDIA3表达。
A. 敲低XBP1发现circPDIA3表达水平被显著抑制;
B. 生物信息学预测XBP1与PDIA3基因启动子的结合位点;
C. CHIP-PCR验证XBP1结合PDIA3启动子的R1位点;
D. 双荧光素酶实验证明XBP1通过结合PDIA3启动子调节circPDIA3表达;
图7:作用机制图。
在结直肠癌细胞对OXA产生耐药性的关键时期,环状RNA分子circPDIA3表达显著升高,并与细胞焦亡关键激活蛋白HSDME-C结合,介导其与另一结构域HSDME-N结合、并且抑制HSDME-C的棕榈酰化,抑制细胞焦亡通路的激活,使肿瘤细胞在药物处理下继续存活,使转录因子XBP1表达显著上调,并通过正反馈进一步增强circPDIA3自身的表达,最终引起肿瘤细胞耐药能力的显著提高。
研究意义
本研究使用Arraystar circRNA芯片在OXA耐药型结直肠癌患者肿瘤组织中进行筛选,发现环状RNA分子circPDIA3显著上调,大样本验证和临床统计结果显示circPDIA3可作为生物标志物预测结直肠癌患者的复发和预后情况,对结直肠癌耐药、复发和转移的治疗都具有良好的理论价值。在实验结果中,作者通过一系列实验表明circPDIA3通过结合GSDME蛋白,抑制细胞焦亡的激活,从而促进结直肠癌细胞对化学药物OXA的耐药性产生,并且还能通过正反馈回路上调XBP1转录因子的表达进一步促进自身表达。这些发现深入研究了环状RNA分子circPDIA3在结直肠癌耐药性产生过程中的作用,并为结直肠癌治疗提供了新的潜在靶点。
原文出处
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1368764624000554?via%3Dihub
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