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南京医科大学许林教授长期从事肺癌的临床和基础研究，肿瘤早期诊断分子标记物及分子致病机理的相关研究，近期该课题组发表了题为“Super-enhancer hijacking LINC01977 promotes malignancy of early-stage lung adenocarcinoma addicted to the canonical TGF-β/SMAD3 pathway”的研究性论文，该文章采用Arraystar超级增强子lncRNA芯片筛选发现LINC01977被超级增强子诱导大量表达，并通过调控TGF-β/SMAD3通路，促进肺腺癌的预后恶化。实验结果显示，linc01977在肺腺癌病人组织和细胞系中，表达量均明显上调。功能研究结果展示linc01977可增强肺腺癌细胞的增殖和迁移能力，敲低linc01977可显著抑制肺腺癌细胞体外增殖。机制研究发现，linc01977与SMAD3结合介导其在细胞核内的积累，激活SMAD3与CBP/P300的相互作用；同时在TGF-β的刺激下表观调控下游靶基因ZEB1，从而促进肿瘤迁移。该研究成果于2022年发表于学术期刊Journal of Hematology & Oncology，影响因子为23.168（Arraystar超级增强子lncRNA芯片由康成生物|数谱生物提供技术服务）。
研究背景
肺癌是世界上最常见的肿瘤类型之一，其中肺腺癌（Lung adenocarcinoma, LUAD）发病率在所有肺癌病例中占比高达40%。切除或联合辅助化疗/放疗的早期LUAD患者有许多会在5年内复发，导致预后恶化。尽管目前已在识别和治疗疾病复发的方法方面取得了长足的进步，但其分子机制仍未得到完整的阐明，因此，发现肺腺癌新的诊断标志物和治疗靶点、揭示导致疾病复发和预后恶化的机制依然极为重要。
超级增强子（super-enhancer, SE）是指具有增强子活性的基因组区域，它通过募集核心调节回路转录因子来介导人类癌症中的转录失调，SE还可产生增强子RNA(eRNA)或劫持启动子促进lncRNA的大量表达，这种lncRNA被称为超增强子相关lncRNA（SE-lncRNA）。据报道，TP63和SOX2通过激活其在鳞状细胞癌中的SE和启动子来协同调节lncRNA LINC01503的表达。受SE和TP63调控的LINC01503激活ERK和AKT通路，促进鳞状细胞癌的进展。然而，在LUAD中SE-lncRNA的功能仍然未知。
研究思路
文章着重于研究SE-lncRNA在肺腺癌中的主要功能和调控机制，作者运用Arraystar超级增强子lncRNA芯片检测5对LUAD癌和癌旁组织中SE-lncRNA的表达水平，采用差异倍数≥2，且P值<0.05筛选出尚未报道过的LINC01977分子，经过超级增强子marker H3K27Ac和H3K4me1 ChIP-Seq验证，LINC01977在肿瘤组织中的表达被SE显著增强，与预后不良密切相关，具有良好的诊断价值。
功能研究发现，在LUAD 细胞系A549中敲低LINC09177抑制细胞增殖，S期细胞减少，细胞自噬得到增强，迁移能力减弱，降低了细胞的克隆形成；裸鼠移植实验发现，抑制LINC01977使肿瘤与对照组相比体积更小、重量更轻且生长迟缓，表明LINC01977的高表达显著促进LUAD的恶性发展。
机制研究分离核质RNA、FISH等实验发现LINC01977定位于细胞核，RNA pulldown揭示LINC01977依赖MH2结构域与SMAD3蛋白结合，促进其在细胞核内的积累，并在TGF-β刺激下促进SMAD3和CBP/P300之间的相互作用，LINC01977通过参与SMAD3/CBP/P300复合物，促进ZEB1启动子H3K27Ac修饰，激活下游肿瘤转移的核心因子ZEB1转录， ZEB1的高表达促进了肿瘤细胞EMT转移过程。被SE劫持的LINC01977可以作为早期LUAD治疗的潜在靶点。
技术路线
结果展示
1. 高通量筛选
图1：LAUD癌和癌旁组织中的SE-lncRNA表达谱发生明显变化。
A Arraystar SE-lncRNA芯片结果的火山图显示LINC01977在癌组织表达上调；
B差异表达SE-lncRNA的circos图。
2. qPCR验证与临床应用
图2：LINC01977在LUAD组织中高表达的验证。
A LUAD癌vs.癌旁组织（n=40）qPCR验证LINC01977表达上调；
B LUAD癌vs.癌旁组织（n=98）RNA scope原位杂交检测LINC01977表达上调；
C KM分析表明LINC01977高表达与预后不良密切相关
3. 功能实验
图3：功能研究证实LINC01977的表达促进LUAD肿瘤的恶性发展。
A In vitro实验证明敲低LINC01977减弱A549细胞的迁移（上图）和增殖能力（下图）；
B-D In vivo实验证明敲低LINC01977抑制移植肿瘤发展（C, 肿瘤重量；D, 肿瘤体积）。
4. 机制实验
图4：机制研究1，LINC01977通过MH2结构域结合SMAD3。
A RNA pulldown-WB证实LINC01977可结合SMAD3；
B 不同HA标记SMAD3蛋白结构域验证LINC01977与SMAD3 MH2结构域相互作用；
C LINC01977介导SMAD3蛋白在细胞核中的积累。
图5：机制研究2，LINC01977参与SAMD3/CBP/P300复合物的形成。
A RNA pull-down验证LINC01977和CBP/P300之间的相互作用；
B RIP和qRT-PCR验证LINC01977和CBP/P300之间的相互作用；
C TGF-β处理下LINC01977/SMAD3与CBP/P300的相互作用（Co-IP）。
图6：机制研究3，LINC01977在TGF-β刺激下显著提高ZEB1表达水平。
A 过表达LINC01977促进ZEB1表达；
B 转染LINC01977和SMAD3后，ZEB1的转录活性在TGF-β处理的A549 细胞中显著升高。
5. 作用机制图
图7：作用机制图
肿瘤微环境中TAM2巨噬细胞激活LUAD肿瘤细胞TGF-β/smad3通路，促进LINC01977上调，LINC01977结合SMAD3并介导其核内积累，参与和促进SMAD3/CBP/P300复合物结合ZEB1并上调其表达，促进肿瘤EMT过程。
研究意义
本研究使用Arraystar SE-lncRNA芯片技术研究LUAD中差异表达的SE-lncRNA，并确定上调的LINC01977被SE劫持，促进体外和体内的肿瘤恶性表型发展，具有良好的病理诊断价值。LINC01977可促进肺腺癌细胞的增殖和迁移，并调控细胞周期和细胞自噬进程。文章讨论了LINC01977结合SMAD3并介导其核内积累，在TGF-β刺激下可参与和促进SMAD3/CBP/P300复合物的建立，并导致下游基因ZEB1的表观遗传激活。由于LINC01977高表达的LUAD患者在早期阶段生存期较短、预后较差，而SE-lncRNA作为早期 LUAD 的重要调控分子和治疗靶标具有良好的诊断和治疗潜力，为LUAD的治疗提供了新的思路。
原文出处
https://jhoonline.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13045-022-01331-2
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