01研究问题
这一类研究问的是：一个已经定好位置的假尿嘧啶（Ψ）位点改变了什么 —— 转录本的稳定性、翻译的效率，还是剪接的结果。修饰数据先要落到位置，问题才谈得上。
Ψ 在 tRNA 上密度很高，这个背景让翻译相关的说法必须先说明针对哪一类 RNA。转录本上的位点与翻译机器一侧的变化是两条不同的证据链，放在一起讲会让结论失去指向。
另一条常见路径是扰动：看位点在某个 Ψ 合成酶被改动之后是否消失，这一步决定了结论能停在描述，还是能说到某个酶负责哪个位置。
02要看哪些指标
- 转录本稳定性：看位点上的 Ψ 比例是否随转录本的寿命变化。
- 翻译效率：看已定位的位点是否与翻译效率的高低、或核糖体停留的位置对应。
- 可变剪接：看靠近剪接位点的位点是否与同一批样本里的异构体比例同向变化。
- 酶特异性：改动某个 Ψ 合成酶之后，位点是否随之消失。
- 类别归属：结果里说清位点落在转录本上还是别的 RNA 类群上，两类读数的解释不同。
mRNA 编码序列上的假尿嘧啶化会改变翻译。Eyler DE et al., PNAS 2019 · DOI 10.1073/pnas.1821754116
03走哪条路线
两条位点级路线读的是同一个修饰，差别在信号类型与同一份文库还能附带读什么，按分析方式选择即可。
| 路线 | 方法 | 读什么 |
|---|---|---|
| 位点级 · 读法一 | 假尿嘧啶 BID-seq | 以缺失特征把每个 Ψ 定位 |
| 位点级 · 读法二 | Ψ 与肌苷 BACS-seq | 以转化特征读 Ψ，同一份文库同时读肌苷 |
| 区段级 | Ψ-RIP-Seq | 跨样本比较时哪些转录本带富集信号 |
| 参考 | 修饰类型总览 | Ψ 与其他修饰的读法差别 |
04可联合研究的平台
下面这些是另一类测量，属于研究设计的一部分，由研究方自有平台或合作平台提供。
- 转录本丰度与周转：可联合 RNA-seq 或表达芯片，把修饰变化与转录本数量、周转速度的变化分开。
- 翻译效率：可联合 Ribo-seq，报告翻译效率与核糖体停留位置，这是编码区位点通常被声称影响的东西。
- 翻译机器一侧的状态：当效应可能来自机器而不是转录本本身时，机器侧的状态由自有平台另行测量。
05项目怎么设
先定修饰落在哪一类 RNA 上，再谈功能。类别不定，后面读到的翻译变化可以被解释成两种不同的原因。
再选一个功能读数作为主问题：稳定性、翻译、剪接各需要自己的测量，选一个作为主结论，其余并排读。
最后让修饰与功能读数共享材料，并保留扰动条件。两侧来自同一份提取物时，比较才成立；要说到某个酶，扰动组与对照组要放在同一个比较里。
06常见问题
BID-seq 与 BACS-seq 该怎么选？
两条路都能把 Ψ 读到单个碱基，区别在信号类型：一条用缺失特征，一条用转化特征。选择取决于数据要怎么定量，以及研究是否需要从同一份文库同时读出肌苷。
Ψ 和肌苷能不能从同一个文库读出来？
能。Ψ 与肌苷的 BACS-seq 版本从一份文库同时报出两个修饰，两份结果落在同一批材料上。它们仍然算两个修饰分别报出，一方的位置不能由另一方推出来。
只做富集够不够支撑位点层面的结论？
不够。富集路线报的是区段，不是位置，接不上剪接边界或编码区这类具体特征，它适合用来挑目标。位置要由同一份材料的位点级路线给出，这也让两侧的数据保持可比。
翻译上的效应怎么判断来自转录本，还是来自翻译机器？
把两侧分开测。转录本上的位点由位点级路线给出；机器一侧的状态需要另行测量。两种来源可以同时存在，只测一侧时，结论就只写到那一侧。
修饰比例与功能读数之间是什么关系？
比例是位点上的一个量，功能读数是另一个量，两者并排读而不是互相换算。把比例与翻译、稳定性放在同一批样本上，才能看出它们是同向还是无关。