m5C RNA单碱基测序（BS-seq）
亚硫酸氢盐把未修饰的胞苷脱氨为尿苷，逆转录后读作 T；m5C 受保护、仍读作 C。C 与 T 两种读出落在同一个位点上，位点的位置和修饰比例一起定下来。
01这项服务报告什么
我们把这条转化路线做成从样本到数据的完整流程：RNA 样本质检、poly(A) 富集与文库构建、上机测序、生物信息分析。每个位点都会注释到参考转录组，给出基因组坐标、宿主基因与所在功能区域。
服务提供三种可报告范围 —— mRNA、mRNA 与 lncRNA、以及 rRNA。rRNA 位点按参考 rRNA 坐标单独注释，可判读范围取决于 m5C 在 rRNA 上的丰度与测序覆盖。
02服务优势
- 转化与完整性兼顾：亚硫酸氢盐条件在让未修饰胞苷充分脱氨的同时，尽量少伤 RNA 骨架，转化产物能顺利进入建库。
- 保护性读出：m5C 不被脱氨、仍读作 C，未修饰位点读作 T，两者在同一份比对结果里构成明确对照。
- 位点级化学计量：同一个位点上的 C/T 读出比例直接换算成该位点的 m5C 修饰比例，可以跨样本比较。
- 无抗体化学法：不需要 m5C 抗体，回避免疫沉淀带来的富集偏倚与交叉反应，也不受抗体批间差异影响。
- 注释完备：每个位点给出基因组坐标、宿主基因，以及编码区（CDS）与非翻译区（UTR）的功能区域归属。
可选转录本范围
mRNA｜mRNA 与 lncRNA｜rRNA03背景与检测原理
抗体富集类方法把 m5C 的分析停在片段层面：分辨率由片段长度决定，抗体自身的结合偏好也会掺进信号里。要在编码区与非翻译区之间分辨位点，需要一种直接把碱基读出来的办法。
BS-seq 用亚硫酸氢盐转化做到这一点。未修饰的胞苷被脱氨为尿苷，逆转录后读作 T；m5C 上带甲基、反应不发生，仍读作 C。比对时看每个位点读出的是 C 还是 T，就把它是否被修饰、以及修饰占多大比例一起判了出来。同一套流程也能覆盖长链非编码 RNA，让 mRNA 与 lncRNA 上的 m5C 在同一次实验里并行看清。
04实验流程
从样本到单碱基 m5C 数据共五步：
05生物信息分析与交付
reads 比对到参考转录组后，识别 C→T 转化特征，在单核苷酸分辨率上换算每个位点的 m5C 修饰比例。分析内容覆盖 motif 特征、metagene 分布、差异甲基化、功能富集与基因组浏览器可视化。
交付内容
- 原始 m5C mRNA 测序数据文件（FASTQ），格式可直接提交 GEO/SRA 等公共数据库。
- 样本质控与测序质控报告，含排序并建索引的 BAM 比对文件与核心比对统计。
- 高置信度单碱基 m5C 位点注释表（XLSX），含基因组坐标、宿主基因与定量结果。
- 单碱基 m5C 转录本特征分布图与一致性 motif 分析图（PDF/PNG）。
- 单碱基分辨率差异 m5C 甲基化分析表（XLSX），含倍数变化与显著性统计。
- m5C 修饰基因的功能富集分析报告（HTML/PDF/PNG）。
- 兼容基因组浏览器的可视化文件（bigWig/bedGraph）与完整的项目分析报告。
06研究应用
- 位点级图谱：在 mRNA 与 lncRNA 上绘制带修饰比例的 m5C 位点图谱。
- 翻译与稳定性：把位点级 m5C 水平与翻译效率、转录本半衰期放在一起分析。
- 区域分布：比较 CDS、5′/3′ UTR 与剪接邻近区域之间 m5C 的分布差异。
- 疾病导向：在疾病与对照之间筛出差异修饰位点，收窄候选生物标志物的验证范围。
- 功能读数说明：翻译效率、转录本半衰期、蛋白或表型等功能读数由研究方或合作平台完成，不在本门户服务清单内。
07常见问题
亚硫酸氢盐处理会不会伤到 RNA？
转化条件经过优化，在让未修饰胞苷充分脱氨的同时控制对 RNA 骨架的损伤，转化后的产物仍能顺利完成文库构建与测序。
C/T 读出比例是怎么换算成修饰比例的？
同一个位点上，带 T 特征的 reads 与带 C 特征的 reads 之比，就是该位点 m5C 的修饰比例。比值落在位点上，可以直接跨样本比较。
没有抗体，位点判读靠什么保证可靠？
判读来自碱基本身的化学差异，不经过免疫沉淀，因此不受抗体结合偏好与批间波动影响；未修饰位点读作 T，为每个位点提供了一重内部对照。
编码区和非翻译区能分开看吗？
可以。每个位点都会注释到参考转录组，并标明它落在 CDS、UTR 还是剪接邻近区域，区域之间的分布差异可以逐类比较。
mRNA、lncRNA 与 rRNA 的位点能不能一起比较？
要分开注释再比较。mRNA 与 lncRNA 可以在同一次实验里并行分析，rRNA 位点按参考 rRNA 坐标单独报告。rRNA 能保留多少位点，取决于 m5C 的丰度与测序覆盖。
08参考文献
- Frommer M, McDonald LE, Millar DS, et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS 1992;89(5):1827-1831. DOI 10.1073/pnas.89.5.1827
- Schaefer M, Pollex T, Hanna K, Lyko F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research 2009;37(2):e12. DOI 10.1093/nar/gkn954
- Squires JE, Patel HR, Nousch M, et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research 2012;40(11):5023-5033. DOI 10.1093/nar/gks144