01研究问题
内部位点定下来之后，常见的说法有三类：翻译效率、转录本稳定性、以及在应激颗粒等凝聚体里的富集。三者是不同的测量，各自需要自己的读数。
还有一层容易被忽略：结论里说「m7G」的时候，要写清讲的是内部位点，还是连帽子一起算。这两件事的证据链不一样。
02要看哪些指标
- 帽子与内部的区分：先确认这一批信号属于哪一边，这是审稿时最先被追问的地方。
- 翻译效率：看编码区或非翻译区的位点是否与翻译效率的高低对应。
- 转录本稳定性：看位点上的修饰比例是否随转录本的寿命变化。
- 凝聚体定位：在确定条件下，看被修饰的转录本是否富集在应激颗粒一类结构里。
- reader 蛋白：找出落在被修饰转录本上的蛋白，并确认它是否依赖这个位点。
03走哪条路线
讨论内部 m7G 时，先分清证据来自哪类 RNA。本站 m7G-Quant-Seq 的已验证范围是 tRNA m7G46 与 18S rRNA m7G1639；它不用于给出内部 mRNA m7G 与帽端位点的判别结论。
转录本内部的 m7G 研究仍要单独确认路线与验证范围。下面的表格用来区分位点级、区段级和参考入口，不把不同 RNA 类别上的结果混成一个判断。
| 路线 | 方法 | 读什么 |
|---|---|---|
| 位点级（tRNA / rRNA 验证） | m7G-Quant-Seq | tRNA m7G46 与 18S rRNA m7G1639 的位点与修饰比例；内部 mRNA 位点需另行确认 |
| 区段级 | m7G MeRIP-Seq | 区段富集（不区分帽子与内部位点） |
| 全清单 | 单碱基 RNA 修饰测序 | 其他可以逐位读出的修饰 |
| 参考 | 修饰类型总览 | m7G 在修饰谱里的位置 |
04可联合研究的平台
下面这些数据各自独立，需要单独设计，由研究方自有平台或合作平台提供。
- 翻译效率：可联合 Ribo-seq，报告翻译效率与核糖体停留位置，这是编码区位点通常被声称影响的东西。
- 组分分离或成像：可联合自有平台的组分分离或成像，确认转录本是否真的富集在被讨论的那个结构里，而不只是出现在同一批样本中。
- RNA-蛋白互作：可联合 eCLIP-seq 与 HyPro-MS，找出落在被修饰转录本上的蛋白，用于跟 reader 蛋白相关的问题。
05项目怎么设
先确认证据来自哪类 RNA。tRNA 与 rRNA 的位点比例可由本站 m7G-Quant-Seq 报告；内部 mRNA 或帽端若进入结论，需要另行确认对应路线。
再把位点与一个功能读数配对。翻译、稳定性、凝聚体定位三者选一个作为主问题，其余并排读而不作主结论。
最后在结论里写明 RNA 类别和验证范围，不把 tRNA、rRNA 与内部 mRNA 的结果合并成一个「m7G 整体」判断。
06常见问题
为什么 m7G 的工作里帽子这么关键？
因为帽子与内部位点带的是同一类化学修饰，一个信号如果没说清来自哪一侧，就没法归给另一侧。讨论内部 m7G 的研究，必须在方法里写清帽子是怎么被排除的，否则结论只能算是对 m7G 的笼统说法。
富集路线能不能把帽子与内部位点分开？
不能。这条路线报告的是转录本层面的富集，不区分两类位置，所以峰无法归给其中任何一侧。它的用处是挑出值得继续追的转录本，若研究需要区分帽端与内部 mRNA，应另行确认具备该判别能力的位点级路线，不能由本页的 tRNA/rRNA 验证结果替代。
最容易站不住的结论是哪一个？
把翻译上的效应归给内部 m7G，却没有把帽子从测量里排除掉。帽子正好在翻译机器结合的位置上，两类信号很容易互相顶替，所以在开头就写清两者怎么分开，比在讨论里补更稳。
凝聚体里的富集怎么与翻译效率的变化区分开？
它们是两件事：一个说的是转录本待在哪里，一个说的是它被翻译得如何。两种现象经常同时出现，要分别测量。若只测了其中一项，结论就只写到那一项为止。
m7G 的位点结果要不要与稳定性一起看？
建议一起看。修饰比例与转录本数量会同时变化，把稳定性或丰度放在同一批样本上，才能分清是修饰变了，还是转录本本身变多变少了。