5hmC RNA 修饰 RIP 测序（hMeRIP-Seq）

羟甲基化与甲基化是两种不同的化学形式：同一个碱基上多一个或少一个羟甲基，结构就变了，抗体认的也是各自的结构，因此甲基化的结果不能拿来替代这条线。

这条路线给出的是分布与组间差异 —— 哪些转录本、哪些区段带修饰，条件变化时怎么动。它不缩到单个碱基，也不折算修饰比例；需要位点级结论时走对应的单碱基路线。

• 认的是羟甲基结构：抗体针对修饰形式本身，不与同一碱基上的甲基化信号混读。
• 避开剧烈处理：整条路线不做碱基转化，转录本不必承受强酸或强氧化条件。
• 抬高稀薄信号：修饰占比低时，先富集能把带修饰片段的占比抬起来，弱信号更容易被读到。
• 自带背景参照：同一份 RNA 留一份不富集同时测序，把真正的富集与高丰度转录本造成的假象分开。
• 讲清能力边界：交付里明确标注结果停在区段层面，不让它被当成位点级的修饰定量。

羟甲基化最早是在 DNA 上被认识的，作为甲基化被氧化后的形式参与去甲基化过程。转录本上同样能检出这个修饰，它属于近年才被系统讨论的一类 RNA 修饰，检测手段至今以抗体富集为主。

具体做法是：RNA 先片段化，识别羟甲基的抗体把带修饰的片段捕获下来，未修饰片段被洗掉；富集产物与未富集的输入对照分别建库测序，比较覆盖深度。被抬高的区段就是候选区域。抗体结合有自己的偏好，抬高幅度只用来圈范围 —— 这是为什么交付停在区段层面。

从 RNA 样本到区段富集图谱，见下图。

分析把富集与输入对照两组数据分别比对，逐区段比较覆盖深度后给出候选富集区段，再做区段注释与组间差异比较。所有统计以区段为单位。

交付内容

• 富集与输入对照两套文库的原始测序数据（FASTQ）。
• 质控报告与比对文件（BAM），含核心比对统计。
• 候选富集区段表（XLSX）：区段坐标、注释基因与富集倍数。
• 区段覆盖分布图（PDF/PNG）。
• 组间差异富集表（XLSX），含倍数变化与统计显著性。
• 功能富集报告（HTML/PDF/PNG）与项目说明文档。

• 分布摸底：先建立转录本与区段层面的羟甲基化分布印象，再决定要不要往分子或位点层面走。
• 发育与病理比较：羟甲基化会随状态变化，适合在两组状态之间比较富集模式的差异。
• 与甲基化结果并读：把羟基化与甲基化的分布放在一起看，判断同一区段上两类形式是否同步变化。
• 候选区段清单：为后续需要更高分辨率的实验圈定优先范围。

1. Delatte B, Wang F, Ngoc L V, et al. Transcriptome-wide distribution and function of RNA hydroxymethylcytosine. Science 2016;351(6270):282–285. DOI 10.1126/science.aac5253