m⁷G & m³C RNA单碱基测序（AlkAniline-Seq）

Q: 两种修饰为什么能落在同一张表上？

因为切断方式相同、掉下来的碱基不同。苯胺在 AP 位点切链，比对时看断在哪个亲本碱基上：鸟苷记 m7G，胞苷记 m3C。两类位点因此来自同一次反应，可以在同一批样本里直接并排比较。

加热加碱使 m⁷G 与 m³C 的碱基脱落、留下 AP 位点，苯胺在该处切断骨架，并在下一个残基上生成 5′-磷酸；接头只从该磷酸端接入，文库由断点向外建起，断点位置即坐标，亲本碱基用于区分两种修饰。

01这项服务报告什么

AlkAniline-Seq 是一种化学测序方法：加热加碱让 m⁷G 或 m³C 的碱基脱落、留下 AP 位点，苯胺在该处切断 RNA 骨架并在下一个残基上生成 5′-磷酸，接头由此接入，断点即修饰位点。

m⁷G 与 m³C 的碱基-核糖键都不稳定。m⁷G 环上的氮带正电荷，m³C 走同一条降解路线，加热加碱即足以使碱基脱离核糖，在链上留下 AP 位点。判断修饰类型不需要额外的化学标记：比对之后，断在鸟苷上的位点记作 m⁷G，断在胞苷上的记作 m³C。

结果按位点给出：每条 RNA 上每个断点的位置，以及末端落在该位的 reads 占该位点覆盖的比例。比例接近 1 的位点几乎总是被修饰，介于中间的位点说明只有一部分分子带这个修饰，这些中间值是组间比较的依据。

02服务优势

单碱基分辨率：断点直接落到单个核苷酸，不需要按区间推断。
断点位置即坐标：文库从新生成的 5′-磷酸向外建起，位置由化学停止的地方决定。
位点级定量：断点下游起始的 reads 在该位点的比例给出 0 到 1 之间的修饰水平，不完全修饰的位点保留中间值。
无抗体读出：不经过免疫沉淀，化学步骤前不做 RNA 类别分级，回避富集环节引入的偏倚。
注释完备：每个位点标注宿主转录本、RNA 类别与所在结构区域，两种修饰按亲本碱基分开列表。

可选转录本范围

mRNA ｜ mRNA 与 lncRNA

03背景与检测原理

m⁷G 分布在 mRNA、rRNA、tRNA 与 miRNA 上，参与 RNA 加工、稳定性、出核与翻译；m³C 同样见于 mRNA、tRNA 与 rRNA，它的写入酶与功能仍在被逐步阐明。两者共享同一个化学弱点：碱基与核糖之间的键比普通残基活泼，这个特点既是它们在细胞内易受影响的环节，也是能一次读出两种修饰的抓手。

可读性来自苯胺。碱基脱落后留下 AP 位点，苯胺驱动 β-消除切断骨架；反应前先用磷酸酶去除内源 5′-磷酸，相邻残基上留下的新 5′-磷酸才能接入接头，未修饰片段不进入文库。同一原理也决定了这条路线在哪里最完整：它在细菌、酵母与人细胞质 / 线粒体的 tRNA 与 rRNA 上经过验证，这些 RNA 的位点目录最完整；转录本层面的位点取决于样本中该 RNA 类别的覆盖深度。

AlkAniline-Seq 检测 m7G 与 m3C 的原理示意 — **图 1。**AlkAniline-Seq 检测原理。加热加碱让 m⁷G 与 m³C 的碱基脱落、留下 AP 位点；苯胺 β-消除切断骨架，在相邻残基上留下 5′-磷酸，接头只从该处接入，断点即修饰位点，亲本碱基区分两种修饰。

反密码子环上的一个甲基，足以改写密码子偏向的翻译与 DNA 损伤应答。Cui J. 等，Nature Communications 2024 · DOI 10.1038/s41467-024-50161-y

04实验流程

从 RNA 样本到单碱基 m⁷G / m³C 数据共五步：样本质检、加热加碱处理（形成 AP 位点）、苯胺裂解（生成 5′-磷酸断端）、文库构建与上机测序、生物信息分析。

**图 2。**AlkAniline-Seq 实验流程，从 RNA 样本到单碱基 m⁷G 与 m³C 数据的五个环节。

05生物信息分析与交付

比对到参考序列后，逐位点统计断端 reads 并换算成该位点的修饰水平：断在鸟苷上的归入 m⁷G 列表，断在胞苷上的归入 m³C 列表。分析给出位点在各 RNA 类别与结构区域上的分布、位点层面的汇总、组间差异比较，以及兼容基因组浏览器的信号轨道。

原始测序数据（FASTQ），按 GEO/SRA 提交格式整理。
样本质控报告、排序后的 BAM 比对文件与核心比对统计。
单碱基 m⁷G 位点表（XLSX）：坐标、宿主转录本与位点修饰水平。
单碱基 m³C 位点表（XLSX）：坐标、宿主转录本与位点修饰水平。
位点在各 RNA 类别与结构区域上的分布图（PDF/PNG）。
组间差异修饰位点表（XLSX），含倍数变化与显著性。
基因组浏览器信号文件（bigWig/bedGraph）与项目结题报告。

06研究应用

翻译调控：把 m⁷G 位点的水平变化与核糖体占据、密码子翻译效率联系起来。
miRNA 加工：读出 m⁷G 对 pri-miRNA 结构与成熟 miRNA 生成的影响。
写入酶研究：比较 METTL1/WDR4 变化前后 m⁷G 位点的差异，m³C 侧对应 METTL6 与 METTL2A/2B。
低丰度 RNA：以总 RNA 为起始材料，把 tRNA 与 rRNA 上丰度不高的位点一并读出。
肿瘤与疾病模型：在肿瘤与正常组织、或敏感与耐药材料之间比较位点谱。
方法交叉验证：把化学断点结果与抗体法或切割法图谱放在同一批样本上并列比较。

07常见问题

两种修饰为什么能落在同一张表上？

因为切断方式相同、掉下来的碱基不同。苯胺在 AP 位点切链，比对时看断在哪个亲本碱基上：鸟苷记 m⁷G，胞苷记 m³C。两类位点因此来自同一次反应，可以在同一批样本里直接并排比较。

断点为什么能当坐标用？

因为接头只接受新生成的 5′-磷酸。碱基脱落、苯胺裂解之后，只有断端带这个磷酸，文库于是从断点向外延伸，读段起点与化学停止的位置一一对应，修饰位点不需要再从富集峰里推断。

位点的修饰比例是怎么算出来的？

末端落在该位的 reads 除以覆盖该位的总 reads，得到 0 到 1 之间的数值。它描述的是这个位点自身的修饰程度，不依赖富集倍数的绝对值，因此不同批次、不同组别可以按同一套口径比较。

不做富集，弱位点会不会被背景淹没？

不会直接被淹没，因为未修饰片段不进入文库。文库只从带 5′-磷酸的断端建起，背景来自化学与建库步骤本身；位点是否可判读更多取决于该 RNA 类别在样本中的覆盖深度，这也是 tRNA 与 rRNA 位点目录最完整的原因。

m³C 在转录本层面的证据为什么仍有分歧？

不同化学路线给出的结论不同：抗体富集类路线曾在 mRNA 上报告富集，而切割类路线在 mRNA 与其他非编码 RNA 中未见同等水平的信号。本方法在 tRNA 与 rRNA 上给出的位点目录最完整，转录本层面的结果取决于覆盖深度与样本状态。

08参考文献

Marchand V, Ayadi L, Ernst FGM, et al. AlkAniline-Seq: profiling of m7G and m3C RNA modifications at single nucleotide resolution. Angewandte Chemie International Edition 2018. DOI: 10.1002/anie.201810946. PMID: 30370969
Zhang LS, Liu C, Ma H, et al. Transcriptome-wide mapping of internal N7-methylguanosine methylene in mammalian mRNA. Molecular Cell 2019. DOI: 10.1016/j.molcel.2019.03.036. PMID: 31031084
Cui J, Sendinc E, Liu D, et al. m3C32 tRNA modification controls serine codon-biased mRNA translation, cell cycle, and DNA-damage response. Nature Communications 2024. DOI: 10.1038/s41467-024-50161-y. PMID: 38982125
Cui J, Liu Q, Sendinc E, et al. Nucleotide resolution profiling of m3C RNA modification by HAC-seq. Nucleic Acids Research 2021. DOI: 10.1093/nar/gkaa1186. PMID: 33313824

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