m6Am 与帽子邻近甲基化
帽子后第一个转录核苷酸上的腺苷，带的是和内部 m6A 相同的甲基，位置却只有一个。围绕它的工作多与稳定性、去帽和帽子身份有关 —— 而这些问题都要求先把帽端的信号与转录本内部的信号分开。
01研究问题
这里问的是帽端那一件事 —— 在给定条件下这个位置是否被甲基化，以及这种状态是否与转录本能存活多久、或者与它的帽子怎么被处理有关。每个转录本只有一个这样的位置，读数因此天然是锚定的，不会摊在整条转录本上。
正因为共用化学，判读时最容易出错的地方也是它：不加区分地把帽端与内部的信号读成一个数，得到的其实是两者的叠加。
02要看哪些指标
- 转录本稳定性：帽端腺苷的甲基化状态是否随转录本存在的时间一起移动。
- 去帽与周转：带修饰的帽端与不带修饰的帽端，处理方式是否不同。
- 翻译起始：第一个核苷酸的状态是否反映在转录本被核糖体启用的效率上。
- 帽子身份：帽子与它后面那个核苷酸一起，构成转录本呈现的 5' 端标识，与「怎么区分自身 RNA 与外来 RNA」这类问题相关。
- 与内部 m6A 的分离：所描述的效果是否真的属于帽端，而不是同一转录本内部的甲基化。
03走哪条路线
帽端与内部是两个不同的测量对象，需要不同的路线；两者可以在同一份材料上同时安排。
| 路线 | 方法 | 读什么 |
|---|---|---|
| 帽端 | m6Am 帽端图谱（m6Am-Exo-Seq） | 外切酶从游离端向内消化、帽子保护它后面的位置，读数落在帽端而不是转录本主体；这条路线不经过抗体富集 |
| 内部 m6A | m6A 单碱基测序（CAM-seq） | 同一批转录本上内部 m6A 的位置与水平，与帽端分开报告 |
| 范围筛查 | m6A 富集图谱（MeRIP-Seq） | 哪些转录本带 m6A 信号（按区段报告），用于先定范围 |
| 参考 | 修饰类型总览 | m6Am 在修饰谱系里的位置，以及它与其他读法的对应关系 |
04可联合研究的平台
下面这些是与修饰检测分开进行的测量，取的是同一批材料，由研究方自有平台或合作平台提供。
- 转录本半衰期：由自有平台按转录抑制的时间序列测转录本消失得多快，这才是稳定性结论真正指向的量。
- 翻译效率：可联合 Ribo-seq，把帽端状态与转录本被启用的方式连起来。
- 5′ 端独立定位：可联合 RNA 5′ 端测序（如 5′ RACE 一类），单独看转录本最前面几个核苷酸，核对图谱报告的位置确实是方法假定的那个位置。
05项目怎么设
先把位置定死：写清楚结论是关于帽端那个腺苷，而不是关于 m6A 这个修饰整体。这一步定不下来，后面所有数字的归属都会含糊。
再选能把帽端与转录本主体分开的路线，并确认内部的信号不会串进这次测量。如果内部 m6A 也在问题里，就让它走单碱基那条线，两者作为两个量分别报告。
最后给图谱配一个功能读数 —— 稳定性或翻译 —— 取同一份 RNA。帽端状态与功能表现必须来自同一批材料，否则读到的只是两个并行的结果。
06常见问题
m6Am 就是换了个位置的 m6A 吗？
化学一样，位置不一样。帽端腺苷每个转录本只有一个，转录本内部的 m6A 则分布在主体各处，两者要分开测量、分开解释。不区分两者的路线，实际上哪个都说不清。
做 m6A 富集能回答 m6Am 的问题吗？
常规富集不区分这两个位置，所以它给出的信号无法归到其中任何一个上。帽端路线绕开这个问题的办法不同：位置由帽子本身定义，读数锚定在这个核苷酸上，而不是靠在抗体结合偏好上取一个范围。
帽端路线为什么不用抗体？
因为位置由帽子决定，不需要靠结合偏好去找。外切酶从游离端向内消化，帽子保护它后面那一段，这同时意味着内部的信号在同一反应里就被去掉了，而不仅是在分析时被排除。
读数给的是每个转录本的值，还是每个位置的值？
它报告转录本帽端的甲基化状态。如果结论需要一个带比例的具体位置，那是另一个问题、另一条路线，必要时两者可以在同一份材料上并行。
帽端与内部都要查，材料需要取两次吗？
不需要。两条路线用同一份提取物分装即可，这样两份数据描述的是同一批材料。分开取材会让两个结论之间多出一个批次变量。