m³C RNA单碱基测序（HAC-seq）

肼-苯胺介导的切割只对胞苷起作用，在 m³C 位点留下可判读的切割与逆转录特征 —— 位点定位到单个核苷酸，修饰水平由切割信号换算。

查看单碱基服务

概述服务优势背景与检测原理实验流程生物信息分析研究应用常见问题参考文献

01这项服务报告什么

HAC-seq 是一条肼-苯胺化学切割的 m³C 测序路线：切割选择性作用于胞苷，在 m³C 位点留下可判读的切割与逆转录特征，据此在单碱基分辨率上定位并定量 N3-甲基胞苷。

我们把这条化学路线做成从样本到数据的完整流程：RNA 样本质检、化学切割与文库构建、上机测序、生物信息分析。每个位点都会注释到参考转录组，给出基因组坐标、宿主基因与所在功能区域。

服务提供两种转录本范围 —— 只做 mRNA，或把 mRNA 与长链非编码 RNA（lncRNA）放进同一次实验一起分析。

02服务优势

肼-苯胺化学切割：切割选择性作用于胞苷，在 m³C 位点留下可判读的切割与逆转录特征。
位点级定位定量：切割信号换算成每个 m³C 位点的修饰水平，中间不经过富集环节。
无抗体读出：不依赖 m³C 抗体，回避富集偏倚与交叉反应。
与富集路线互补：切割不依赖抗体效率，可作为正交证据独立验证富集路线提示的位点。
注释完备：每个位点都带基因组坐标、宿主基因与功能区域，方便把修饰结果与基因注解对齐。

可选转录本范围

mRNA｜mRNA 与 lncRNA

03背景与检测原理

胞苷上的 N3 甲基不改变碱基配对，测序读到的序列里不会留下天然印记，所以要用化学手段把它的位置显出来。这也是 m³C 长期难以被逐位点读出的原因。

HAC-seq 用肼-苯胺介导的切割做到这一点：切割选择性作用于胞苷，在修饰位点留下可判读的切割与逆转录特征。比对时读出这些特征，N3-甲基胞苷就定位到单个核苷酸，修饰水平由切割信号换算。整条路线不经过抗体富集，判定不依赖抗体效率。这条路线同样支持长链非编码 RNA：把 mRNA 与 lncRNA 放进一次实验，两边的 m³C 一起解析。

HAC-seq 检测 m3C 的原理示意 — **图 1。**HAC-seq 检测原理。肼-苯胺介导的切割选择性作用于胞苷，在 m³C 位点留下切割与逆转录特征，从而在单碱基分辨率上定位并定量 N3-甲基胞苷。

核苷酸分辨率的化学切割，把 m³C 从一条难以读出的修饰变成了可以逐位点核对的标记。Cui J et al., Nucleic Acids Research 2021 · DOI 10.1093/nar/gkaa1186

04实验流程

从样本到单碱基 m³C 数据共五步：

**图 2。**HAC-seq 实验流程，从 RNA 样本到单碱基 m³C 数据的五个环节。

05生物信息分析与交付

比对完成后，按切割特征逐位点计算 m³C 的修饰水平。下游分析给出 motif 偏好、metagene 分布、组间差异修饰与功能富集，并配套基因组浏览器轨道文件。

交付内容

m³C mRNA 测序的原始数据文件（FASTQ 格式），可直接上传 GEO/SRA 等公共数据库。
样本质检结论与测序质控报告，附排序建索引的 BAM 文件及核心比对统计。
高置信度的单碱基 m³C 位点清单（XLSX）：基因组坐标、宿主基因、修饰水平一览。
转录本特征分布图（metagene）与 m³C motif 一致性分析图（PDF/PNG）。
位点级差异修饰分析表（XLSX），给出倍数变化与显著性检验结果。
功能富集分析报告（GO 与 KEGG 等），输出 HTML、PDF 与 PNG 三种格式。
基因组浏览器可视化文件（bigWig/bedGraph）与完整的项目分析报告一并交付。

06研究应用

转录组范围定位：在 mRNA 与 lncRNA 上绘制 m³C 位点图谱，建立修饰基线。
与富集路线互验：用化学切割结果独立确认富集路线提示的位点，把两类证据分开核对。
翻译调控：把位点水平的 m³C 与翻译效率、转录本的稳定性表现对应起来看。
疾病导向：在疾病与对照之间筛出差异修饰位点，作为候选生物标志物的起点。
功能读数说明：翻译效率、转录本半衰期、蛋白或表型等功能读数由研究方或合作平台完成，不在本门户服务清单内。

07常见问题

肼-苯胺切割为什么能定位到单个碱基？

切割选择性作用于胞苷，遇到 N3 甲基胞苷时留下的切割与逆转录特征位置固定，比对时读出特征出现的位置，修饰核苷酸就锁在单个碱基上。

切割信号怎么换算成位点级的 m3C 水平？

同一个位点上带切割特征的 reads 与总 reads 之比，换算成该位点 m³C 的修饰水平。这一步落在位点层面，不经过富集，因此不引入富集倍数的干扰。

化学切割路线和抗体富集路线该怎么选？

要独立证据、避免抗体效率带来的不确定性，选化学切割；样本里目标片段丰度很低、希望先提升信噪比，则抗体富集更合适。两条路线也可以并用，互为正交验证。

m3C 在编码区与 UTR 的分布能比较吗？

可以。位点会注释到参考转录本并标明区域归属，CDS 与 UTR 之间的分布差异可以逐类比较。

低丰度位点在这条路线里能被检出吗？

化学切割不依赖富集，弱位点不会被富集倍数放大也不会被压掉，判读结果取决于该位点是否有足够的测序覆盖深度。

08参考文献

Cui J, Liu Q, Sendinc E, Shi Y, Gregory RI. Nucleotide resolution profiling of m3C RNA modification by HAC-seq. Nucleic Acids Research 2021;49(5):e27. DOI 10.1093/nar/gkaa1186
Gao Y, Hou J, Wei S, et al. Transcriptome-wide mapping of N3-methylcytidine modification at single-base resolution. Nucleic Acids Research 2025;53(5):gkaf153. DOI 10.1093/nar/gkaf153

m3C RNA单碱基测序（HAC-seq）