m5C RNA 修饰 RIP 测序（MeRIP-Seq）
用识别 5-甲基胞嘧啶的抗体把带修饰的片段拉下来再测序，报告 m5C 富集在哪些转录本、哪些区段 —— 这条路线给出的是范围，不是位置。
01这项服务报告什么
胞嘧啶甲基化不改变碱基配对，常规逆转录测序看不出修饰与未修饰的区别，这也是单碱基路线要先做化学转化的原因。抗体富集换了一个角度：把带修饰的片段单独分出来，用片段多少的差异说话。代价是结论停在区段上，不落到单个碱基，也不折算成修饰比例。
服务支持两种转录本范围：只做 mRNA，或把 mRNA 与长链非编码 RNA（lncRNA）并入同一次实验一起分析。
02服务优势
- 不做化学转化：抗体路线不经过亚硫酸氢盐一类的处理，转录本不必承受剧烈条件。
- 先分开再读：修饰比例不高的样本，富集抬高目标片段占比，信号更容易显现。
- 输入对照配套：同一份 RNA 留一份不富集，用来区分真正的富集与高丰度转录本造成的假象。
- 结论边界清楚：交付内容写明结果停在区段层面，不把富集信号当成含量来读。
- 与定位路线衔接：富集结果圈定候选区段，需要精确位置时再交给单碱基路线。
可选转录本范围
mRNA｜mRNA 与 lncRNA03背景与检测原理
m5C 是在胞嘧啶第五位碳上加上一枚甲基，在 mRNA、非编码 RNA 以及 tRNA、rRNA 上都能检测到。它的化学改变很小，逆转录时仍与鸟嘌呤配对，读出来的序列和未修饰的胞嘧啶没有差别 —— 常规测序里不含这条线索。
抗体富集绕开了这个限制。RNA 先片段化，含 m5C 的片段被抗体捕获，未修饰片段被洗掉，富集部分建库测序；另一半未富集的片段作为输入对照同时测序。比对后比较两组覆盖深度，被抬高的区段就显现出来。抗体对序列环境有偏好，抬高幅度受此影响，信号因此只用来圈范围。
04实验流程
从总 RNA 到区段富集图谱共五个环节，见图 2。判断哪些区段真实富集时，把富集组与输入对照放在一起看 —— 抗体路线给出的是相对信号，用来圈定候选范围。
05生物信息分析与交付
reads 比对到参考转录本后，用富集组与输入对照的覆盖深度差计算区段富集程度，输出富集区段表。分析内容覆盖区段在转录本上的位置分布、序列特征、组间差异富集与相关基因的功能富集。
交付内容
- m5C 抗体富集测序的原始读长文件（FASTQ），可直接提交 GEO/SRA 等公共数据库。
- 从样本到测序的质控报告，附排序并建索引的 BAM 比对文件与核心比对统计。
- 富集区段表（XLSX）：区段坐标、所属转录本，以及富集组与输入对照的比较结果。
- 富集区段在转录本上的位置分布图与序列特征分析图（PDF/PNG）。
- 组间差异富集表（XLSX）与对应基因的功能富集报告（HTML/PDF/PNG）。
- 基因组浏览器通道文件（bigWig/bedGraph）与完整的项目分析报告。
06研究应用
- 分布普查：先在转录组范围圈出带 m5C 富集的转录本与区段，为后续定点验证划定范围。
- 与甲基转移酶、读码蛋白关联：把富集区段与 NSUN 家族、读码蛋白的表达变化或敲低表型放在一起比较。
- 处理前后比较：应激、代谢改变或药物处理前后，看同一条转录本上的富集区段是否发生迁移。
- 与定位路线配对：先用富集把候选缩到少数转录本，再用单碱基路线在候选范围里求解位置。
- 多修饰并排：与同一批样本的 m6A、ac4C 富集区段并排看，比较不同修饰的分布是否重叠。
07常见问题
m5C 不改变碱基配对，抗体富集是怎么把它读出来的？
常规逆转录下，修饰与未修饰的胞嘧啶读出来一模一样，靠序列特征识别不出来。抗体路线换了思路：把带修饰的片段单独拉出来，再用富集组与输入对照的覆盖深度差定位区段。
富集到的区段能不能直接当成修饰位点？
不能。区段宽度主要由片段化长度决定，一段几十到几百个碱基的范围里可能只有一个修饰。要给出碱基级位置，需要另走单碱基路线。
换一批样本，同一条转录本上的富集区段为什么会变？
富集信号受抗体批次、片段化程度与测序深度影响，跨批次直接比区段宽度会失真。比较组间差异时用输入对照归一化，并把对照与处理样本放在同一批次里做。
手上还有单碱基路线，先做哪一个？
看问题落在哪一层。要先知道哪些转录本被修饰、范围有多宽，先做抗体富集；已经锁定少量候选、要给出具体位置与比例，直接上单碱基路线更省事。
tRNA、rRNA 上的信号要不要一起看？
m5C 在 tRNA 与 rRNA 上也有分布，不做区分的话，这部分信号会与 mRNA 上的信号混在一起。我们按转录本类型分别统计，结果里能看出信号来自哪一类 RNA。
08参考文献
- Squires JE, Patel HR, Nousch M, et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research 2012;40(11):5023-5033. DOI 10.1093/nar/gks144
- Edelheit S, Schwartz S, Mumbach MR, Wurtzel O, Sorek R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics 2013;9(7):e1003602. DOI 10.1371/journal.pgen.1003602