01研究问题
这一点决定了方法不能通用。读碱基修饰的路线看的是某个核苷酸是否被修饰，读糖基化的路线看的是 RNA 上连着的那条糖链，两者的文库构建、捕获方式与判读层次都不一样。
所以这类项目通常拆成三段：先知道哪些分子带信号，再确认信号落在哪一类 RNA 上，最后看样本整体的糖基化水平与分子大小分布。三段用的可以是同一份 RNA。
02要看哪些指标
- 筛查结果：跨条件比较哪些分子带糖基信号，把候选范围先定下来。
- 分子身份：带信号的分子的序列与类型，并区分长链 RNA 与小 RNA 两类。
- 总量与分布：样本里糖基化 RNA 的总量与分子大小分布，不需要事先选定目标分子。
- 原始数据：可直接载入基因组浏览器的信号文件，以及可提交公共数据库的原始数据。
03走哪条路线
三条路线对应三个层次，通常在同一份材料上分装完成、互相配合；只有先做筛查、再做整体判断的项目也常见。
| 路线 | 方法 | 读什么 |
|---|---|---|
| 筛查 | GlycoRNA 芯片筛查 | 哪些分子带糖基信号 |
| 定性 | GlycoRNA 测序 | 带糖基的 RNA 是什么（长链与小 RNA 分列） |
| 整体 | GlycoRNA 整体检测 | 样本的总量与分子大小分布 |
| 参考 | 修饰类型总览 | 糖基化与碱基修饰的区别 |
04可联合研究的平台
糖基化信号要落到功能上，通常还要把结果与下面这些平台的数据放在一起看；这些平台由研究方自有平台或合作平台提供。
- 转录本丰度：可联合 RNA-seq 或表达芯片，把糖基信号的变化与转录本数量的变化分开。
- 细胞表面与组分定位：可联合成像或流式平台，判断带信号分子是否出现在预期的位置上。
- RNA-蛋白互作：可联合 eCLIP-seq 与 HyPro-MS，找出与糖基化 RNA 结合或识别糖链的蛋白，把信号与机制连起来。
05项目怎么设
先定路线组合，再定材料。三个层次可以在同一份提取物上分装完成，分开采集材料会让后续的跨层次比较失去基础。
条件之间的比较要提前写进方案：糖基化信号很容易被丰度变化盖住，把表达读数与糖基读数放在同一批样本上，结论才分得清是修饰变了还是转录本多了。
最后确认结论停在哪个层次。筛查给的是候选分子清单，整体检测给的是样本层面的水平与分布；要把某个分子与某个功能连起来，需要另外设计扰动或功能读数，不能从糖基信号直接推出来。
06常见问题
GlycoRNA 是碱基修饰吗？能用 m6A、m5C 那套方法读吗？
不是。糖基化改变的是 RNA 上连着的糖链，不是某个核苷酸本身，读碱基修饰的化学路线读不到它。糖基化有自己的三条路线：筛查、测序与整体检测。
筛查、测序和整体检测该按什么顺序做？
看结论需要哪一层。只要一份候选分子清单，筛查就够；要说明信号落在哪一类 RNA 上，需要测序；只想看样本整体水平与大小分布、不预设目标，就做整体检测。三者用同一份 RNA 分装即可，不需要分别采材料。
整体检测不依赖代谢标记，这一点为什么值得提？
代谢标记要把标记物喂进细胞、等它掺进糖链，需要较长的孵育时间，培养条件不好控制时很难安排。用凝集素直接识别天然糖基就跳过了这一步，检测的是样本里本来就存在的糖基化 RNA。
糖基化信号的变化怎么与转录本丰度的变化分开？
把表达读数放在同一批样本上。糖链信号与转录本数量会一起涨落，只测糖基化容易把丰度变化读成修饰变化；两者并排看，结论才能得到校验。
长链 RNA 与小 RNA 的糖基化要分开做吗？
测序侧是两个针对不同长度类群的选项，按目标选择即可；筛查与整体检测不区分长度，可以先用来定范围，再决定进哪一条测序路线。