hm⁵C RNA单碱基测序（WO-Seq）

hm⁵C 比 m⁵C 多一个羟基。WO-Seq 利用这个差别：过氧钨酸盐把 hm⁵C 氧化为 thT，TGIRT 在逆转录时把 thT 读作 T，测序结果中该位点表现为 C→T。未修饰 C 和 m⁵C 基本不被氧化，仍读作 C。

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概述服务优势检测原理实验流程分析交付研究应用常见问题参考文献

01这项服务报告什么

WO-Seq 是一种免亚硫酸氢盐的 hm⁵C 单碱基测序方法。过氧钨酸盐把 5-羟甲基胞苷氧化为三羟基化胸腺嘧啶（thT），TGIRT 把 thT 读作 T，C→T 改变标出 hm⁵C 的位置。

结果按位点列出：转录本、坐标、支持 T 的 reads 数、该位点覆盖度，以及两者的比值。位点来自比对，数值来自 reads，不依赖富集区间的形状。

这个比值是相对 hm⁵C 相关信号。氧化和逆转录不一定完全，T reads 还包含背景错配和测序错误，所以它适合比较用同一流程处理的样本，不等于全部 hm⁵C 分子中被修饰的比例。部分修饰的位点会得到中间值。

02服务优势

这条路线适合 hm⁵C 含量低、抗体富集难以定位的样本。

单碱基分辨率：信号是单个碱基的替换，位点判断不依赖片段末端或峰形。
氧化选择性：过氧钨酸盐氧化 hm⁵C；在所用条件下，m⁵C 和未修饰 C 基本不被氧化。
位点级定量：支持 T 的 reads 数除以该位点覆盖度，得到相对信号；部分修饰的位点保留中间值。
无抗体化学法：反应前不做免疫沉淀，总 RNA 可以直接使用；抗体富集的结合偏好被避开，其他偏差仍然存在。
注释完备：位点注释到转录本和转录本区域。

服务名称

hm⁵C RNA单碱基测序（WO-Seq）

03背景与检测原理

m⁵C 在胞苷环的第 5 位带一个甲基。TET 酶在这个甲基上加一个羟基，生成 hm⁵C。RNA hm⁵C 已在翻译、神经生物学和发育研究中被关注；其分布和功能仍在研究中，哺乳动物样本中含量较低。

常规亚硫酸氢盐测序不能可靠区分这两种修饰。未修饰胞苷脱氨后读作 T，m⁵C 和 hm⁵C 都可能抗脱氨，读作 C，两种修饰在结果中合并。处理需要酸碱循环，会降解 RNA；双链区转化不完全时还会出现假阳性。

WO-Seq 不使用脱氨反应。过氧钨酸盐把 hm⁵C 的羟甲基氧化为 thT。反应在单链核酸上进行得较好，在双链 DNA 中效率较低。RNA 并非完全单链，二级和三级结构会影响部分位点的氧化效率。TGIRT 在 cDNA 中对应位置掺入 A，测序时读作 T。在所用条件下，未修饰 C 和 m⁵C 基本不被氧化。

氧化和逆转录不一定完全，T reads 还包含背景错配和测序错误。报告值是相对 hm⁵C 相关信号，不是绝对修饰比例，适合比较用同一流程处理的样本。一个位点能否判定，取决于该位点的覆盖度；检出灵敏度还取决于 RNA 丰度、结构环境和转化效率。

WO-Seq 检测 hm5C 的原理示意 — **图 1。**过氧钨酸盐把 hm⁵C 氧化为 thT，未修饰 C 和 m⁵C 基本不变；TGIRT 把 thT 读作 T，C→T 改变标出 hm⁵C 位点。

hm5C 的氧化产物 thT 在 cDNA 合成时被读作 T，因此可以在 RNA 上做 hm5C 的单碱基测序。Yuan F. 等，Chemical Communications 2019 · DOI 10.1039/C9CC00274J

04实验流程

流程分五步：样本质检、过氧钨酸盐氧化、TGIRT 逆转录、文库构建与测序、数据分析。

WO-Seq 实验流程 — **图 2。**从 RNA 样本到 hm⁵C 位点表的五个环节。

05生物信息分析与交付

比对后，统计每个胞苷位点支持 T 的 reads 数。候选位点按覆盖度和局部背景筛选；同一转录本上的其他胞苷不默认视为未修饰，所用阈值写入项目报告。组间比较考虑覆盖度和背景，统计检验需要生物学重复。分析包括位点注释和 C→T 信号轨道。

原始测序数据（FASTQ），按 GEO/SRA 格式整理。
质控报告、BAM 文件和比对统计。
hm⁵C 位点表（XLSX），含坐标、转录本和相对 C→T 信号。
每个位点的 C→T reads 数与覆盖度表（XLSX）。
C→T 图谱和位点分布图（按转录本区域，PDF/PNG）。
组间差异 hm⁵C 相关信号表（XLSX），含倍数变化和显著性。
基因组浏览器轨道文件（bigWig/bedGraph）和项目报告。

06研究应用

TET 相关研究：比较 TET 缺失、过表达或抑制样本中的 hm⁵C 位点。
翻译研究：把位点水平与核糖体占据、翻译效率一起分析。
发育与神经生物学研究：在分化和相关模型中观察 hm⁵C 的变化。
低丰度样本：抗体富集困难时，可用化学法直接检测 hm⁵C。
方法比较：与同一批样本的 hMeRIP-seq 或亚硫酸氢盐数据比较。

07常见问题

亚硫酸氢盐为什么不能区分 hm⁵C 和 m⁵C？

未修饰胞苷脱氨后读作 T，m⁵C 和 hm⁵C 都可能抗脱氨，读作 C。常规亚硫酸氢盐测序不能可靠分开两者。处理还会降解 RNA，双链区转化不完全时会出现假阳性。

氧化反应识别什么？

过氧钨酸盐作用于 hm⁵C 的羟甲基，把它氧化为 thT。m⁵C 没有羟基，基本不被氧化；未修饰胞苷也基本不被氧化。

为什么读出是 C→T？

TGIRT 在 thT 对应的位置掺入 A，cDNA 中该位置为 T，测序结果中原来的 C 变成 T。未修饰 C 和 m⁵C 通常不产生这个改变。

C→T 比例能直接比较吗？

用同一流程处理的样本之间可以比较。不同实验室或不同流程之间不宜直接比较，因为氧化和逆转录的效率不同，T reads 还包含背景错配。这个信号是相对值，不是绝对修饰比例。

位点水平可以用在哪些研究里？

可以比较 TET 相关处理前后的 hm⁵C 位点，也可以比较正常与疾病样本，或与翻译效率数据一起分析。位点落在单个胞苷上，适合跟踪具体位置的变化。

08参考文献

Yuan F, Bi Y, Siejka-Zielinska P, et al. Bisulfite-free and base-resolution analysis of 5-methylcytidine and 5-hydroxymethylcytidine in RNA with peroxotungstate. Chemical Communications 2019;55:2328-2331. DOI: 10.1039/C9CC00274J.
Delatte B, Wang F, Ngoc LV, et al. Transcriptome-wide distribution and function of RNA hydroxymethylcytosine. Science 2016;351:282-285. DOI: 10.1126/science.aac5253.
Fu L, Guerrero CR, Zhong N, et al. Tet-mediated formation of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. Journal of the American Chemical Society 2014;136:11582-11585. DOI: 10.1021/ja505305z.
Okamoto A, Sugizaki K, Nakamura A, et al. 5-Hydroxymethylcytosine-selective oxidation with peroxotungstate. Chemical Communications 2011;47:11231-11233. DOI: 10.1039/c1cc14782j.
Hayashi G, Koyama K, Shiota H, et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine by one-pot bisulfite-free chemical conversion with peroxotungstate. Journal of the American Chemical Society 2016;138:14178-14181. DOI: 10.1021/jacs.6b06428.

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