测序结果之外，LC-MS 补了什么
测序与质谱被要求做同一件事的次数足够多，差别容易被忽略：一类报告位置，另一类报告样品里化学上有什么。放在一起读，它们回答的是各自单独都回答不了的问题。
01内容导读
两者回答不同的问题，有用的地方在于知道某个结论需要哪一类证据。这篇说明各自报告什么、独立测量在哪里挣到自己的位置，以及质谱在哪里帮不上忙。
02要点
- 结论只压在一个判读上时。当某个位点或某个修饰独自承担整条论证，一个独立的检查能让这条论证不必只依赖一条流程。
- 比较的是两条测序路线时。两套共享同一底层假设的化学之间的一致性，看起来比实际更有力，一次物理测量能把这个循环打开。
- 涉及不熟悉的修饰时。某个修饰的检测化学比较新时，先独立确认样品里有什么，是合理的第一次核验。
- 材料有限且珍贵时。质谱跑的是选定、分离得到的一段 RNA，而不是全转录组，因此它是对某个组分做检查，而不是做普查。
- 结论关于某个修饰的总量时。要问一段确定的 RNA 群体里改过的核苷占多少，组成学就是被要求的那种测量。
- 位置已经知道时。位点清单在手、要确认的是这批材料里有没有这个修饰，两类方法配合起来几乎不浪费工作量。
03展开说明
区别在两份结果长什么样上最容易看出来。测序结果是一张清单：转录本、位置、水平。质谱结果是一份组成：这份材料里有哪几种核苷，各自占多大比例。
| 修饰测序 | LC-MS | |
|---|---|---|
| 读的是 | 修饰碱基处 RNA 的行为表现 | 核苷本身，按质量分离 |
| 结果是什么 | 一个位置，以及该位置上的水平 | 一份组成，针对被分析的那段 RNA |
| 可以和什么比较 | 经由同一条流程跑出的其他样本 | 用同样方式分析的其他制备物 |
| 给不了什么 | 超出该化学所能报告的范围之外的信息 | 位置、转录本，或单位点比例 |
第一行是两者最常被混起来的地方。测序流程自带一套化学，而任何一套化学都有报告得好的碱基和报告得差一些的碱基。质谱带的是另一种前提：这个核苷可以被分离、可以被检出。两者一致的地方，就是一个结果经过了两条互不相关的路径。
这也是值得跑一次这类测量的场景：一个由测序判读的位置，与同一批 RNA 上用物理方法测到的同一个修饰，比用同一套化学的两个版本各判一次要有力。
04对研究设计的意义
如果整篇文章的结论压在某个位点上，那么在设计阶段就值得问一句：这个判读要不要一个独立角度的确认，如果不要，理由是什么。大多数单方法的结论是能够成立的，只是把理由写清楚，比事后补一次测量容易。
反过来也要避免把两类结果做数字上的换算。一类是位置上的水平，另一类是某个制备物上的比例，它们只能被读成一致或不一致，没有哪一步算术能把其中一个变成另一个。
05常见问题
既然 LC-MS 给不出位置，为什么还要做？
因为关于位置的论证通常建立在一个反推之上。对同一批材料里化学上有什么做一次独立测量，是另一类证据，这也是该方法被用作核验而不是普查的原因。
两类结果能直接做数值比较吗？
不能。一个是某个位置上的水平，另一个是某个制备物上的比例，所以只能读成一致或不一致，而不是同一个数字的两个版本。如果测序结果是单位点比例，也没有哪一步算术能把两者互换。
组成学测量对材料有什么要求？
需要选定并分离得到的一段 RNA。这个要求定义了该技术在项目里的适用范围，也是它与整份总 RNA 上机测序在实践中的差别，因此它是对一个确定组分的检查。
组成学结果阳性，说明位点清单是对的吗？
它说明这个修饰存在于这份材料里，这是一个关于组成的陈述，而不是关于位置的陈述。它是否落在报告出来的那些位置上，仍然要由解位置的路线回答，所以两者是彼此一致，而不是一个确证另一个。
只做一类测量时，怎么说明结论的可靠性？
把可靠性建立在流程内部的对照与重复上，并写清该化学能报告什么、不能报告什么。对于较新的修饰，公开的位点清单本身还不多，此时内部对照的作用比外部比对更大。