m7G RNA单碱基测序（m7G-Quant-Seq）
KBH4 在室温下还原 m7G，温和脱嘌呤把还原后的位点转成 AP 位点；逆转录在这里产生混合变异或缺失，按总变异率定位并定量 m7G46。
01这项服务报告什么
Aksomics 提供从总 RNA 样本质检、tRNA/rRNA 建库、测序到生物信息分析的完整流程。论文在人细胞中检测了 22 个胞质 tRNA 的 m7G46 位点，并以 18S rRNA m7G1639 作为方法验证位点。
服务提供三种可报告范围 —— mRNA、mRNA 与 lncRNA、以及 rRNA。rRNA 位点按参考 rRNA 坐标单独注释，可判读范围取决于 m7G 在 rRNA 上的丰度与测序覆盖。
02服务优势
- KBH4 还原：KBH4 在室温下还原 m7G，温和脱嘌呤再把还原后的位点转成 AP 位点。
- 混合变异读出：AP 位点在 HIV RT 逆转录中产生 G→A/C/T 突变和缺失，按总变异率判定修饰。
- 位点级化学计量：用与序列 motif 匹配的校准曲线，把总变异率换算成每个位点的 m7G 修饰比例。
- 无抗体化学法：不依赖抗体富集，避免抗体结合偏好；建库和测序偏差仍在。
- 已验证的 RNA 范围：人细胞胞质 tRNA 的 m7G46 位点和 18S rRNA m7G1639 位点均完成单碱基定位。
- 注释完备：tRNA 位点按成熟序列编号，并给出宿主基因、反密码子与 isoacceptor。
可选转录本范围
mRNA｜mRNA 与 lncRNA｜rRNA03背景与检测原理
tRNA 的 m7G 主要位于可变环第 46 位，由 METTL1/WDR4 复合物写入。m7G46 参与维持 tRNA 三级结构，并影响解码与翻译效率。
m7G-Quant-Seq 先用高浓度 KBH4 在室温下还原 m7G，再在 pH 2.9、45 °C 条件下进行温和脱嘌呤，把还原后的位点转成 AP 位点。AP 位点在 HIV RT 逆转录时产生 G→A/C/T 突变和缺失，混合变异模式随序列 motif 而变化。
把突变和缺失合并为总变异率，再用匹配 motif 的校准曲线换算，即可估计每个位点的 m7G 修饰比例。论文在人细胞胞质 tRNA 中定位并定量了 22 个 m7G46 位点，并报告 18S rRNA m7G1639 位点。
04实验流程
从样本到单碱基 m7G 数据共五步：
05生物信息分析与交付
比对后统计每个候选 G 位点的突变、缺失和覆盖度，计算总变异率，并按序列 motif 选择校准曲线，给出位点级 m7G 化学计量。分析包括 motif、位点分布、组间差异与基因组浏览器可视化。
交付内容
- 原始 m7G tRNA/rRNA 测序 FASTQ 数据文件，可直接提交至 GEO/SRA 等公共数据库。
- 样本质控与测序质控报告，含排序并建索引的 BAM 比对文件与核心比对统计。
- 高置信度单碱基 m7G 位点注释表（XLSX），含成熟 tRNA 坐标、宿主基因、反密码子、isoacceptor 与化学计量。
- 单碱基 m7G 位点在各 RNA 类别与结构区域的分布图，以及 motif 分析图（PDF/PNG）。
- 单碱基分辨率 m7G 差异位点表（XLSX），含倍数变化等统计信息。
- 兼容基因组浏览器的 m7G 信号可视化文件（bigWig/bedGraph）及结构化报告。
06研究应用
- tRNA m7G 图谱：在总 RNA 样本中绘制成熟 tRNA 的 m7G46 位点图谱。
- 结构–功能关联：把 m7G46 与 tRNA 稳定性、折叠状态关联。
- 翻译保真度：将 m7G 变化与解码准确性和翻译效率联系起来。
- 方法学验证：把 18S rRNA m7G1639 与 tRNA m7G46 一起作为流程校准与阳性参考。
- 疾病相关：筛选疾病相关的 tRNA m7G 位点。
- 功能读数说明：翻译效率、转录本半衰期、蛋白或表型等功能读数由研究方或合作平台完成，不在本门户服务清单内。
07常见问题
tRNA 上的 m7G 位点如何读出？
KBH4 先还原 m7G，温和脱嘌呤再形成 AP 位点。逆转录在该位置产生突变或缺失，统计总变异率并按 motif 校准，即可定位并定量 m7G46。
为什么要在逆转录后同时统计突变和缺失？
AP 位点的逆转录产物不只出现一种替换。G→A、G→C、G→T 和缺失都要计入总变异率，并按序列 motif 匹配校准曲线，才能得到稳定的位点级 m7G 比例。
m7G 位点可以做组间比较吗？
可以。比较时应使用同一套 KBH4 还原、脱嘌呤和逆转录条件，并保留生物学重复。结果同时查看位点覆盖度、总变异率和 motif 校准值，避免把丰度变化误判成修饰变化。
18S rRNA m7G 位点有什么用途？
18S rRNA m7G1639 在论文中用于展示变异率与校准流程。它可以作为同批实验的方法参考，帮助判断还原、脱嘌呤和逆转录是否按预期工作。
mRNA、lncRNA 与 rRNA 的位点能不能一起比较？
要分开注释再比较。mRNA 与 lncRNA 可以在同一次实验里并行分析，rRNA 位点按参考 rRNA 坐标单独报告。rRNA 能保留多少位点，取决于 m7G 的丰度与测序覆盖。
08参考文献
- m7G-quant-seq: Quantitative Detection of RNA Internal N7-Methylguanosine. ACS Chemical Biology 2022;17(12):3306-3312. DOI 10.1021/acschembio.2c00792
- Zhang LS, et al. Transcriptome-wide mapping of internal N7-methylguanosine methylome in mammalian mRNA. Molecular Cell 2019;74(6):1304-1316. DOI 10.1016/j.molcel.2019.03.036