01内容导读
关键的区分在于「一个文库读两个修饰」与「两个实验各读一个修饰」。前者共享材料与化学，两份结果来自同一批分子、同一次转化步骤；后者每份结果自带一套流程，两者之间的可比性需要论证，而不能默认。
02要点
- 先写句子。把结论写成一句只涉及一个修饰的话，看它是否仍然需要第二个修饰。如果不需要，这个项目就是一个单修饰研究外加一次额外的实验。
- 想清第二个修饰在做什么。作为对照、作为背景，还是作为同一个结论的另一半——三种用途需要三种设计，在样本与解释上的代价也不同。
- 各臂保持同一种输入类型与同一套质量标准。两个修饰测的是同一批 RNA，取材与处理上的差别会和生物学差别混在一起，无法分开。
- 先在同一修饰内比较，再跨修饰比。变化的幅度与方向要对回到该修饰自己的对照上；跨修饰之间没有共同的刻度。
- 只在同一层级上比较。位点对位点，或转录本对转录本。混着比可以在讨论里出现，不能出现在一张暗示同一测量的图里。
- 提前定好第二个修饰平坦意味着什么。如果某一臂出现阴性结果就让另一臂失效，这个设计已经把两次测量做成了一个结论。
03展开说明
读任何一种双修饰设计，最有用的方法都是先问这两臂共享什么——因为共享的部分，正是可以不加论证就进行比较的部分。
| 设计 | 两份结果共享什么 | 需要论证什么 | 它支撑什么 |
|---|---|---|---|
| 两个修饰出自同一个文库 | 材料、文库化学与测序运行 | 每个修饰的信号被正确归到了对应的修饰上，因为两者从同一份读数里读出 | 两个修饰在同批分子内部如何关联 |
| 同一批样本上的两个实验 | 样本采集、处理与输入质量 | 两套流程可比，包括各自的对照与各自能检出的范围 | 两个修饰在同一套样本里各自的表现 |
| 一个测位置、一个测转录本 | 样本处理与输入类型 | 两份结果不在同一个刻度上，因为只有一份带位置 | 一个关于关联的假设，而不是两者的单位点测量 |
| 一个测序结果加一个正交测量 | 材料，以及被检视的那段 RNA | 两类方法回答的是不同问题，而不是同一个问题做了两遍 | 对某修饰是否存在及其水平的独立核验 |
前两行之间的界线最常被模糊。共享一个文库在解释上是实打实的优势，但它同时意味着共享暴露：化学里某一步对其中一个修饰的偏好会朝同一个方向影响另一个，而这看上去会像两份结果彼此印证。
第四行才是第二个测量挣到位置的地方。位置与组成是同一段 RNA 的两个不同属性，所以其中一个的结果是另一个前面的证据，而不是它的重复。
04对研究设计的意义
如果第二个修饰的作用是「背景」，那么它在样本量上的要求通常低于主修饰，但它在取材与处理上必须与主修饰完全一致，否则背景不成立。如果它的作用是「同一个结论的另一半」，那么两个修饰的分辨率就要相当，否则结论最终只能落在较低的那一层上。
还有一件在设计阶段就该定的事：两个修饰要不要用同一套阈值与判读标准。每种修饰的路线不同，判读标准各自成立；把它们统一成一个标准，通常是以牺牲其中一个的准确性换来的整齐。
05常见问题
两个修饰用一个文库读，总是更好的设计吗？
当两个修饰化学上相关、经由同一套转化读出时，它更好，因为材料、文库化学与测序运行都共享。它并不是读任意两个修饰的通用捷径，而共享一个文库同时也是一次共享暴露。
两个修饰能按各自的比例比较吗？
只能在各自内部比较。比例由特定方法产生，方法之间没有共同刻度，某个修饰的数字更大并不表示它修饰得更多，所以每个比例都在自己的方法内、对该方法自己的对照来读。
这里的「正交」指什么？
指对同一批材料做另一类测量，例如位置对组成，使其中一个结果成为另一个前面的证据而不是重复。两条测序路线测同一个属性并不算正交，因为它们共享同一种读数的前提。
一个双修饰项目应该从哪里开始？
从这项研究要支撑的那句话开始，以及这句话说的是哪个修饰。先把结论写出来，看它是否仍然需要第二个修饰，再按它能贡献什么来选择第二个——对照、背景与同一结论的另一半各自需要不同的设计。
第二个修饰结果不变化，会影响主结论吗？
如果设计阶段已经说明它是背景或对照，那么它持平本身就是一个结果，主结论并不依赖它必须移动。如果没有提前说明，一个平坦的结果会让两个修饰之间的关系无从判断。