m³C RNA单碱基测序（m3C-IP-seq）

免疫沉淀先把含 m³C 的片段富集出来，逆转录错配读出再把修饰核苷酸落到单个碱基 —— 丰度偏低的位点也有机会进入判读范围。

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概述服务优势背景与检测原理实验流程生物信息分析研究应用常见问题参考文献

01这项服务报告什么

m3C-IP-seq 是一条抗体富集结合逆转录错配读出的 m³C 测序路线：免疫沉淀特异富集含 m³C 的片段，再由 RT misincorporation（逆转录错配）把修饰核苷酸落到单个碱基上，适合检出丰度偏低的 m³C 位点。

流程自 RNA 样本质检起，依次为免疫沉淀富集、逆转录错配读出与建库、上机测序、生物信息分析。每个位点都会注释到参考转录组，给出基因组坐标、宿主基因与所在功能区域。

服务提供两种转录本范围 —— 只做 mRNA，或把 mRNA 与长链非编码 RNA（lncRNA）放进同一次实验一起分析。

02服务优势

富集提升灵敏度：免疫沉淀特异富集含 m³C 的片段，弱修饰位点也能被检出。
错配读出定位：富集之后做逆转录错配读出（misincorporation），逆转录在修饰位点处留下特征信号，把修饰核苷酸落到单个碱基上。
低丰度友好：先富集再测序以提升信噪比，适合 m³C 丰度偏低的样本。
与化学路线互补：可与肼-苯胺切割这类无抗体路线互为正交验证。
注释完备：输出逐位点标注基因组坐标、宿主基因与所在功能区域。

可选转录本范围

mRNA｜mRNA 与 lncRNA

03背景与检测原理

m³C 在转录本上的丰度总体偏低。如果把 total RNA 直接建库测序，弱修饰位点很容易淹没在背景里，判读不到。

m3C-IP-seq 用两步化解这个问题。第一步是免疫沉淀：抗体特异富集含 m³C 的片段，先提高目标片段在文库里的占比。第二步是逆转录错配读出（RT misincorporation）：逆转录在修饰位点处留下特征信号，比对时读出这个信号，修饰核苷酸就落到单个碱基上。富集负责灵敏度，错配读出负责位点级判读，两者各司其职。长链非编码 RNA 同样纳入：mRNA 与 lncRNA 可以放在同一次实验中并行分析。

m3C-IP-seq 检测 m3C 的原理示意 — **图 1。**m3C-IP-seq 检测原理。抗体先把含 m³C 的片段免疫沉淀下来，逆转录错配读出再让逆转录在修饰位点处留下特征信号，把修饰核苷酸定位到单个碱基。

把抗体富集与逆转录错配读出接在一起，低丰度的 m³C 位点才有机会被逐位点读出。Gao Y et al., Nucleic Acids Research 2025 · DOI 10.1093/nar/gkaf153

04实验流程

从样本到单碱基 m³C 数据共五步：

**图 2。**m3C-IP-seq 实验流程，从 RNA 样本到单碱基 m³C 数据的五个环节。

05生物信息分析与交付

比对完成后识别逆转录错配特征，锁定修饰位点并计算每个位点的 m³C 修饰水平。下游涵盖 motif 与 metagene 分布、组间差异、功能富集，以及可直接载入基因组的可视化轨道。

交付内容

m³C mRNA 测序 FASTQ 原始文件，格式满足 GEO/SRA 等数据库的提交要求。
样本与测序两级质控报告，包含比对后的 BAM（已排序建索引）与核心比对统计。
单碱基 m³C 位点表（XLSX），逐位点给出基因组坐标、宿主基因与修饰水平。
转录本特征分布与 motif 一致性两张分析图（PDF/PNG）。
差异修饰分析表（XLSX），含组间倍数变化与显著性统计。
修饰基因的功能富集分析报告（HTML、PDF、PNG）。
可直接载入基因组浏览器的 bigWig/bedGraph 文件，以及完整项目报告。

06研究应用

富集定位：在 mRNA 与 lncRNA 上定位 m³C 位点，重点覆盖丰度偏低的修饰。
与化学路线互验：交叉确认肼-苯胺切割等无抗体路线提示的位点，两条独立证据分开核对。
翻译与稳定性：把位点水平的 m³C 与翻译效率、转录本半衰期的变化联系起来。
疾病导向：比较疾病与对照样本的修饰差异，缩小候选标志物的验证范围。
功能读数说明：翻译效率、转录本半衰期、蛋白或表型等功能读数由研究方或合作平台完成，不在本门户服务清单内。

07常见问题

为什么这条路线要先做免疫沉淀？

m³C 的丰度偏低，直接测序时弱位点的信号容易淹没在背景里。免疫沉淀先把含修饰的片段挑出来，目标片段占比提高之后，弱位点才有机会被读到。

富集之后再做错配读出，位点级信息会不会被拉回片段层面？

不会。富集针对的是含修饰的片段，逆转录错配读出针对的是片段里的修饰核苷酸；逆转录特征出现的位置仍然精确到单个碱基，富集只影响检出灵敏度，不改变判读的粒度。

低丰度样本为什么更适合这条路线？

因为信噪比在测序之前就被抬高了：目标片段先富集，测序数据里属于修饰位点的比例上升，同样深度下弱位点更容易过阈值。

和化学切割路线的结果对不上时怎么判断？

两条路线的偏倚来源不同 —— 富集路线受抗体效率影响，化学切割路线受切割效率影响。两条路线一致支持的位点可以优先进入后续验证；只在一条路线出现的位点，需要结合覆盖深度与重复实验再下判断。

这项服务是否也覆盖长链非编码 RNA？

覆盖。我们提供只做 mRNA、以及 mRNA 与 lncRNA 两种范围，两类转录本在同一次实验里一起分析。

08参考文献

Gao Y, Hou J, Wei S, et al. Transcriptome-wide mapping of N3-methylcytidine modification at single-base resolution. Nucleic Acids Research 2025;53(5):gkaf153. DOI 10.1093/nar/gkaf153
Cui J, Liu Q, Sendinc E, Shi Y, Gregory RI. Nucleotide resolution profiling of m3C RNA modification by HAC-seq. Nucleic Acids Research 2021;49(5):e27. DOI 10.1093/nar/gkaa1186

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