01研究问题
两类常用路线给出的答案不在同一层。富集路线报告信号在转录本与区段上的累积，得到的是候选范围；逐碱基的化学或酶学读出报告具体核苷酸，以及该位置上带修饰的转录本占比。
所以图谱项目从「结论需要什么分辨率」开始。如果结果里要写出一个位置，路线本身就得给出位置；否则图谱只能停在区段层面，而区段层面的结论无法支撑「某个核苷酸被修饰」这类说法。
02要看哪些指标
- 位点表：逐位点给出基因组坐标、宿主基因、功能区域归属与修饰比例，这是图谱的主体。
- motif 与分布：位点的序列偏好与在转录本上的分布，用于和已发表的数据集对照。
- 组间差异修饰：同一批位点在条件之间的变化，含倍数变化与显著性统计。
- 轨道与原始数据：可直接载入基因组浏览器的信号文件，以及可用于公共数据库提交的原始数据与比对统计。
03走哪条路线
常见修饰里，m6A、m5C、m1A、ac4C、m7G、m3C、假尿嘧啶、肌苷、2′-O-甲基化等都有逐碱基判读的路线；还没走到位点的目标，先用富集路线把范围定下来。
| 路线 | 方法 | 读什么 |
|---|---|---|
| 单碱基路线（示例） | m6A CAM-seq · m5C BS-seq · m1A-Quant-seq | 位点与比例 |
| 单碱基路线（全清单） | 单碱基 RNA 修饰测序（12 个方法） | 位点级图谱 |
| 富集路线 | RNA 修饰 RIP 测序 | 区段富集 |
| 先查覆盖范围 | 修饰类型总览 | 哪些修饰有单碱基路线 |
04可联合研究的平台
图谱本身描述的是修饰状态，要解释它的后果，通常还要把图谱与下面这些平台的结果放在一起看；这些平台由研究方自有平台或合作平台提供。
- 转录本丰度：可联合 RNA-seq 或表达芯片，把修饰差异与表达变化分开，避免把丰度变化当成修饰变化。
- 结构信号：可联合 R-loop 测序（DRIPc-seq）与 G4 结构图谱，用于解释位点为何落在某些区域。
- RNA-蛋白互作：可联合 eCLIP-seq 与 HyPro-MS，把位点与结合蛋白、与调控机制连起来。
05项目怎么设
先定修饰与材料，再定比较。单张图谱描述的是一个状态，多数图谱项目会让两组样品彼此对照，因为一个状态的图谱无法区分真实差异与样本间波动。
对照要在样品上机之前写进方案：比较的两侧用同一套流程处理，修饰差异才能归给条件本身。
最后确认分辨率与结论是否匹配。结论要给出核苷酸，就走单碱基路线；先用富集路线做预筛的项目，把候选送进单碱基路线时也要保持同样的分组与对照逻辑。
06常见问题
富集路线拿到的峰，能不能当成位点图谱用？
不能。峰给的是候选区段而不是坐标，一个峰里可能叠着多个候选位置。要写出具体核苷酸，需要把候选区段送进单碱基路线再做一轮。
位点表里的修饰比例指的是什么？
指该位置上带修饰的转录本在样本中的占比，由该位点 reads 的组成换算而来。它是样本层面的量，所以适合在条件与样本组之间比较；它本身不说明这个修饰有什么功能。
只做一张图谱够不够？
如果目的是建立基线，一张图谱是有价值的；如果要做结论，多数项目会设置两组比较，因为一个状态的图谱无法把真实差异与样本波动分开。比较关系值得在上机前就固定下来。
怎么确认关注的修饰能不能读到单碱基？
修饰类型总览列出了我们覆盖的修饰，并标明其中哪些有单碱基路线。没有单碱基路线的修饰，任何测序方法都给不出它的位置，方案要从区段层面写起。
位点落在编码区还是 UTR，对结论有影响吗？
有。位点会注释到功能区域，编码区、非翻译区与剪接邻近区域对应不同的功能预期，所以位点表里的区域归属是解读时最先看的一列。