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单细胞测序技术服务 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 单细胞全转录组测序 |
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生物分子凝聚体研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 CoIP-MS/AP-MS |
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NGS测序技术服务 DRIPc-seq |
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NGS测序技术服务 环状DNA测序 |
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基因芯片技术服务 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表观转录组学测序服务 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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NGS测序技术服务 DNA（羟）甲基化测序（抗体法） DNA甲酰基胞嘧啶(5fc)修饰测序 DNA 5hmC 测序（化学法） 染色质免疫共沉淀测序 |
PCR技术服务 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖体-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
压力应激颗粒的定义及功能机制概述
压力应激颗粒（stress granules，简称SGs）是一种由RNA和RNA结合蛋白形成的生物分子凝聚体。当真核细胞受到来自外界的压力(如热休克、氧化应激、营养缺乏等)时，细胞质内通过液液相分离（Liquid-liquid phase separation）会快速形成SGs，作为mRNA和蛋白质的临时避难所，调节mRNA的翻译和降解。研究表明，SG的动态缺陷与多种疾病发生密切相关，包括神经退行性疾病、癌症、自身免疫性疾病等[1]。
m6A是mRNA上最丰富的修饰，在细胞质中m6A修饰的mRNA可以与m6A识别蛋白YTHDF1-3结合，影响mRNA稳定性及翻译。近期研究发现，m6A修饰的mRNA可以在SGs富集并影响mRNA翻译，且mRNA上的m6A修饰越多，mRNA越长，越容易诱导YTHDF蛋白接近和相分离，并驱动m6A RNA-YTHDF蛋白复合物在SGs富集[2]。
文章案例简介
哈佛大学庄小威教授近期发表于NCB的文章“m6A-binding YTHDF proteins promote stress granule formation”研究了m6A mRNA-YTHDF复合物与SG形成的关系。
文章首先构建了m6A修饰酶Mettl3 KO前后的U2OS细胞，LC-MS检测发现Mettl3 KO细胞中mRNA的m6A修饰总量下降了约40%。为了探究压力条件下m6A修饰的mRNA在U2OS细胞的亚细胞分布，文章利用NaAsO2诱导压力应激颗粒形成，通过FISH/IF实验发现，m6A mRNA在压力应激颗粒富集倍数（4-5倍）高于一般mRNA（约3倍）（图1a）。文章进而通过SG RNA测序和m6A LAIC seq检测SG中的mRNA类型，丰度和m6A修饰RNA的百分比。结果显示，相对较长（>3000 nt）mRNA的m6A比率与SG富集之间存在正相关关系，相对较短（<3000 nt）的mRNA则很少在SG富集（图1b）。利用smFISH/IF共定位进一步验证了不同m6A比率的mRNA在SGs中的定位，显示出m6A修饰程度更高的mRNA更易在SG中富集（图1c）。
此外，文章发现YTHDF1作为m6A识别蛋白能够促进SG组装（图2），并且与分布于SGs的marker蛋白G3BP1外围的蛋白RPS10（40S核糖体蛋白S10）有共定位，表明YTHDF1可能与压力条件下SG外围的翻译机制相关，并有助于加速压力消除后m6A mRNA的翻译恢复（图3）。
文章结果展示
1.M6A mRNA在SG中富集
图1. a IF/FISH实验显示，m6A mRNA在NaAsO2诱导形成的SG中富集。G3BP1：SGs marker蛋白；DCP1A：P body marker蛋白。bc RNA测序和m6A测序分析发现长的m6A修饰比例高的mRNA富集于压力应激颗粒。
2.YTHDF蛋白IDR和YTH结构域促进SGs形成
图2. 左 YTHDF1/3 siRNA敲低抑制SG形成和mRNA在SG富集；右 YTHDF1-3 IDR或YTH结构域缺失影响SG形成。
3.YTHDF蛋白和核糖体蛋白共定位于SG外周
从m6A mRNA切入，关联压力应激颗粒的研究思路
受上述文章启发，从m6A mRNA入手，关联SGs的研究可参考以下思路。通过Arraystar表观转录组芯片/MeRIP-seq筛选到差异m6A修饰的mRNA后，进行HyPro临近标记实验[3]筛选与疾病相关的目标m6A mRNA结合的蛋白，如果富集到m6A reader蛋白和压力应激颗粒marker蛋白，可以进行深入功能机制研究：通过对mettl3等m6A相关蛋白过表达敲除，观察细胞表型变化，FISH/IF探讨mRNA与压力应激颗粒的共定位及相分离情况等，Ribo-seq、RNC PCR研究m6A RNA翻译是否有变化。
参考文献：
[1] Protter DSW, Parker R. Trends Cell Biol. 2016. PMID: 27289443
[2] Ye Fu, Xiaowei Zhuang. Nat Chem Biol. 2020. PMID: 32451507
[3] Yap, Karen et al. Mol Cell. 2022. PMID: 34741808
康成生物|数谱生物能提供的服务
Arraystar lncRNA&mRNA表观转录组芯片技术服务
RNC PCR
