方案概览
这个方案把修饰酶表达、整体修饰水平与单碱基位点三层证据串起来：NuRNA™ Human tRNA 修饰酶 PCR 芯片检测 85 个关键的修饰酶与蛋白因子，LC-MS tRNA 修饰检测定量 55 种核苷修饰，tRNA 修饰测序（m¹A / m³C / m¹G / m²,²G）、m⁷G TRAC-Seq 与 m³C HAC-Seq 把位点定到单碱基，用于确认酶的靶点并解释机制。
化学修饰由 tRNA 修饰酶动态催化 [1]。修饰酶的突变或失调与疾病相关，例如胞嘧啶 5 位 RNA 甲基转移酶 NSUN2 的突变与头小畸形相关 [2]，t6A 甲硫基化酶与 2 型糖尿病相关 [3]；tRNA 修饰如何被修饰酶调控，正是需要深入研究的方向。
方案组合三层证据：芯片给出 85 个修饰酶与蛋白因子的表达，LC-MS 给出 55 种核苷修饰的整体水平，修饰测序与 TRAC-Seq / HAC-Seq 把特定修饰定位到单碱基，用来确认酶的靶点。
服务一览
| 服务 | 在这个方案中的作用 |
|---|---|
| NuRNA™ tRNA Modification Enzymes PCR 芯片（H） | 一次检测 85 个关键的 tRNA 修饰酶与蛋白因子 |
| LC-MS tRNA 修饰检测 | 同时定量 55 种核苷修饰，给出整体修饰谱 |
| tRNA 修饰测序（m¹A / m³C / m¹G / m²,²G） | 四类甲基化修饰的单碱基定位 |
| m⁷G tRNA 单碱基测序（TRAC-Seq） | m⁷G 位点定位到单碱基分辨率 |
| m³C tRNA 单碱基测序（HAC-Seq） | m³C 位点定位到单碱基分辨率 |
上表中的检测均由数谱生物提供，可以单独使用，也可以按课题所处阶段组合。
方案优势
为什么用这套方案做修饰酶机制研究
- 85 个酶的芯片：一次检测 85 个经验证或预测的 tRNA 修饰酶与蛋白因子
- 整体修饰谱：LC-MS 定量 55 种核苷修饰，反映样本的整体修饰状态
- 单碱基位点定位：用化学特异的方法把酶的作用位点定位到核苷酸水平
- 严格验证：芯片在多种组织与细胞系中验证，并带完整质控
- 疾病关联：覆盖 NSUN2—头小畸形、CDKAL1—2 型糖尿病等酶与疾病的对应关系
- 证据链整合：表达、定量与位点定位可以在一个项目中组合推进
背景介绍
tRNA 在转录后带有大量化学修饰，这些修饰塑造并微调 tRNA 的折叠、稳定性与解码等各方面功能，并由 tRNA 修饰酶动态催化 [1]。
修饰酶的突变或失调与疾病相关：胞嘧啶 5 位 RNA 甲基转移酶 NSUN2 的突变与头小畸形相关 [2]，t6A 甲硫基化酶与 2 型糖尿病相关 [3]。tRNA 修饰在疾病中的重要性正在被逐步认识，也说明这方面还有大量工作可做 [4, 5]。
实验与数据分析流程
从酶的表达一路走到它催化的位点
样本与 RNA 质检保留小 RNA 的提取与严格 QC
酶表达谱NuRNA™ PCR 芯片检测 85 个酶
整体修饰定量LC-MS 定量 55 种核苷修饰
位点定位修饰测序与 TRAC / HAC 定位单碱基
整合解读把酶、整体水平与位点对应起来
生物信息与交付
每个服务都包含详细分析：芯片项目交付带质控与归一化参考的表达数据，LC-MS 项目交付原始与归一化峰数据及色谱图，测序项目交付修饰位点、水平与 motif 分析。
- 85 个 tRNA 修饰酶的表达数据（含归一化参考与质控）
- LC-MS 原始与归一化峰数据，以及核苷的总离子流色谱图
- 单碱基分辨率的修饰位点与修饰水平
- 火山图、IGV 比对展示与序列 motif 分析
- 可直接用于展示与汇报的图表
研究应用
修饰酶靶点与机制在不同疾病方向的应用
- 神经发育异常：NSUN2 突变与头小畸形相关；异常的 tRNA 甲基化把细胞应激与神经发育异常联系起来（EMBO J, 2014）
- 2 型糖尿病：t6A 甲硫基化酶（如 CDKAL1）与 2 型糖尿病风险相关（Hum Mol Genet, 2014）
- 肿瘤：METTL1 介导的 Arg-TCT tRNA m⁷G 修饰驱动恶性转化，METTL1 过表达在多种恶性肿瘤中推动肿瘤发生
- 心血管疾病：tRNA 修饰与修饰酶缺陷与心脏疾病及线粒体相关疾病有关
- 翻译调控：通过靶点研究修饰酶如何影响 tRNA 的折叠、稳定性与解码
- 靶点确认：用单碱基位点数据确认某个修饰酶的下游靶标，把酶与功能后果连起来
方案选择对照
| 对比维度 | NuRNA™ PCR 芯片 | LC-MS 修饰检测 | 修饰测序 / TRAC / HAC |
|---|---|---|---|
| 证据层面 | 修饰酶与蛋白因子的表达 | 核苷修饰的整体水平 | 单碱基分辨率的修饰位点 |
| 更适合 | 筛出哪些酶发生了变化 | 定量整体修饰变化 | 确认具体酶的下游靶点与位点 |
| 主要输出 | 85 个酶的表达 | 55 种核苷修饰的定量 | 位点位置、水平与 motif |
常见问题
NuRNA™ PCR 芯片覆盖哪些酶？
NuRNA™ Human tRNA 修饰酶 PCR 芯片检测 85 个参与 tRNA 修饰的关键酶与蛋白因子，包括 ADAT1/2/3、ALKBH1/8、CDKAL1、METTL1、METTL2A/2B、NSUN2/6、PUS1/3/10、TRMT1、TRMT6/61A 等，每个都标注了对应的修饰类型。
怎么确认某个酶的下游靶点？
先用 NuRNA™ PCR 芯片看酶的表达变化，再用 LC-MS 定量整体修饰变化；要确认具体位点，用 tRNA 修饰测序（m¹A / m³C / m¹G / m²,²G）、m⁷G TRAC-Seq 或 m³C HAC-Seq，它们把修饰定位到单碱基分辨率。
为什么要把 LC-MS 和单碱基测序结合？
LC-MS 一次定量 55 种核苷修饰，给出样本的整体修饰谱；测序方法则把具体修饰定位到某条 tRNA 的某个碱基上。两者结合，既能说明整体水平怎么变，也能指出酶的靶点在哪里。
哪些疾病与 tRNA 修饰酶相关？
目前已有明确关联的包括头小畸形（NSUN2 突变）、2 型糖尿病（t6A 甲硫基化酶，如 CDKAL1）、肿瘤（METTL1 介导的 m⁷G）、神经系统综合征、心脏疾病以及与线粒体相关的疾病。
生物信息分析包含哪些内容？
芯片项目包含带归一化参考与质控的表达数据；LC-MS 项目包含原始与归一化峰数据及色谱图；测序项目包含修饰位点、修饰水平、火山图、IGV 比对展示与序列 motif 分析。
参考文献
- [1] El Yacoubi B, et al. Biosynthesis and function of posttranscriptional modifications of transfer RNAs. Annual Review of Genetics, 2012. PMID: 22905870
- [2] Blanco S, et al. Aberrant methylation of tRNAs links cellular stress to neuro-developmental disorders. The EMBO Journal, 2014. PMID: 25063673
- [3] Zhou B, et al. Identification of a splicing variant that regulates type 2 diabetes risk factor CDKAL1 level by a coding-independent mechanism in human. Human Molecular Genetics, 2014. PMID: 24760768
- [4] Kirchner S, Ignatova Z. Emerging roles of tRNA in adaptive translation, signalling dynamics and disease. Nature Reviews Genetics, 2015. PMID: 25534324
- [5] Zhang X, et al. Small RNA Modifications: Integral to Function and Disease. Trends in Molecular Medicine, 2016. PMID: 27840066