服务优势
- 单碱基分辨率：断点直接落到成熟 tRNA 的单个位置，不需要按区间推断。
- 断点位置即坐标：文库只从新生成的 5′-磷酸向外建起，位置由化学停止的地方决定。
- 位点级定量：断点下游起始的 reads 在该位点的比例给出 0 到 1 之间的修饰水平，部分修饰的位置保留中间值。
- 无抗体读出：不经过免疫沉淀，化学步骤前不做 tRNA 分级，总 RNA 直接进反应。
- 注释完备：位点标注成熟 tRNA 相对坐标、宿主 tRNA 基因、反密码子、isoacceptor 与结构域。
背景介绍
AlkAniline-Seq是一种化学测序方法：加热加碱让 m⁷G 或 m³C 的碱基脱落、留下 AP 位点，苯胺在该处切断 RNA 骨架；反应前先用磷酸酶去除内源 5′-磷酸，下一个残基上生成的新 5′-磷酸由此接入接头，断点即成熟 tRNA 上的修饰位置。
两个位点的作用都来自骨架而非碱基配对。可变环的 m⁷G 稳定 L 形折叠中两个臂的夹角；反密码子环的 m³C 约束环的摆动幅度，影响解码的速度与准确性。位点是否被修饰、修饰到什么程度，是这条路线要回答的问题。
难点在于两个位点难以单独读出：tRNA 很短、二级结构紧凑，修饰又挤在相邻的几个核苷酸上，整体定量会把位点之间的差异平均掉。这条路线不依赖对碱基的化学改造，只利用核糖在断裂反应中的表现，因此不需要先做 tRNA 分离，也不需要抗体富集。
实验流程
样本质检RNA 完整性与纯度
加热加碱m⁷G 与 m³C 脱碱基、留下 AP 位点
苯胺裂解断端生成 5′-磷酸
文库构建与测序从断点向外建库
生物信息分析逐位点判定与定量
生物信息分析
位点判定与定量
读段比对到精选参考序列后逐位点统计断端 reads：断在鸟苷上的归入 m⁷G 列表，断在胞苷上的归入 m³C 列表，并按成熟 tRNA 相对坐标、反密码子与结构域整理。
分布与比较
汇总位点在各类 tRNA、isoacceptor 与结构域上的分布，并给出组间差异比较结果。
交付内容
- 原始 FASTQ 数据文件，可直接提交至 GEO/SRA 等公共数据库。
- 含 BAM 比对文件与关键比对指标的质控报告。
- 单碱基 m⁷G 位点表（XLSX），含成熟 tRNA 坐标、反密码子、isoacceptor 与位点修饰水平。
- 单碱基 m³C 位点表（XLSX），含成熟 tRNA 坐标、反密码子、isoacceptor 与位点修饰水平。
- 位点在各类 tRNA 与结构域上的分布图（PDF/PNG）。
- 组间差异修饰位点表（XLSX），含倍数变化与显著性。
- 兼容基因组浏览器的信号文件（bigWig/bedGraph）与结构化 tRNA 报告。
研究应用
- 解码与翻译：把反密码子环 m³C 与摆动位解码、密码子偏向性翻译联系起来。
- 写入酶研究：读出 METTL1/WDR4 变化对 m⁷G 位点的影响，以及 METTL6、METTL2A/2B 对 m³C 位点的影响。
- 低丰度位点：以总 RNA 为起始材料，把丰度不高的 tRNA 位点一并读出。
- 应激与疾病模型：比较不同处理或疾病状态下同一 tRNA 家族的位点水平。
- isoacceptor 比较：在同一套编号下比较不同 isoacceptor 的修饰差异。
- 方法交叉验证：与抗体富集或小 RNA 富集路线在同一批样本上并列比较。
常见问题
为什么两种修饰能落在同一张表上？
因为切断方式相同，脱落的碱基不同。苯胺在 AP 位点切链，比对时看断在哪个亲本碱基上：鸟苷记 m⁷G，胞苷记 m³C。可变环与反密码子环的位点来自同一次反应，可以在同一批样本里直接并排比较。
断点为什么能当坐标用？
因为接头只接受新生成的 5′-磷酸。碱基脱落、苯胺裂解之后，只有断端带这个磷酸，文库于是从断点向外延伸，读段起点与化学停止的位置一一对应，位点不需要再从富集峰里推断。
位点的修饰比例是怎么算出来的？
末端落在该位的 reads 除以覆盖该位的总 reads，得到 0 到 1 之间的数值。它描述的是这个位点自身的修饰程度，不依赖富集倍数的绝对值，因此不同样本与组别可以按同一套口径比较。
m³C 的位点在不同 tRNA 家族之间一致吗？
不一致。m³C 由 METTL6 与 METTL2A/2B 在不同 tRNA 家族上写入，落在反密码子环的固定位置，但哪些家族带这个修饰取决于样本类型与状态，因此结果按成熟 tRNA 编号与 isotype 逐位点给出，便于按家族比较。
参考文献
- [1] Marchand V, et al. AlkAniline-Seq: profiling of m7G and m3C RNA modifications at single nucleotide resolution. Angewandte Chemie International Edition 2018. DOI: 10.1002/anie.201810946. PMID: 30370969.
- [2] Lin S, et al. Mettl1/Wdr4-mediated m7G tRNA methylome is required for normal mRNA translation and embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Molecular Cell 2018. DOI: 10.1016/j.molcel.2018.06.001. PMID: 29983320.
- [3] Cui J, et al. m3C32 tRNA modification controls serine codon-biased mRNA translation, cell cycle, and DNA-damage response. Nature Communications 2024. DOI: 10.1038/s41467-024-50161-y. PMID: 38982125.