服务优势
- 单核苷酸分辨率：切割位点直接对应修饰位置，不依赖富集区间的推断。
- 化学特异性：依靠化学反应而非抗体亲和富集，减少非特异结合带来的背景。
- 对照设计严谨：同批样品设去甲基化对照组（DM-HAC），修饰被去除后切割消失，据此排除假阳性。
- 与富集法互补：化学切割结果可以独立复核抗体富集法发现的关键位点。
- 定量可读：切割信号强度可用于评估位点水平的修饰程度。
背景介绍
HAC-Seq（肼-苯胺切割测序）是一种以单核苷酸分辨率定位 tRNA m³C 的测序方法。样品经肼与苯胺处理后在 m³C 位点特异性切割，产生的 5′ 片段末端受损、无法连接接头，测序只捕获全长片段与 3′ 切割片段，据此判定切割位置。
m³C 在维持 tRNA 结构、解码准确性与翻译效率方面发挥作用，已有研究把它与线粒体功能、细胞周期以及 DNA 修复等通路联系起来。位点一旦变化，可能影响反密码子环的局部构象。
由于该位点信号相对弱，单靠化学切割容易与背景混淆，因此方法上必须配合去甲基化对照——这是把 HAC-Seq 的结论做扎实的前提。
Mettl8 定位于线粒体，特异性地为线粒体 tRNA^Thr/Ser(UCN) 加上 m³C；在皮层神经干细胞中敲除 Mettl8，会降低线粒体蛋白的翻译水平。 Zhang F, et al. Cell Stem Cell 2023;30(3):300-311.e11. PMID: 36764294
实验流程
样本质检RNA 完整性与纯度
分组处理实验组 / DM 对照
肼-苯胺切割m³C 位点断裂
建库测序捕获两类片段
位点判定对照扣除与定量
生物信息分析
位点鉴定
比较实验组与对照组的读段分布，锁定差异切割位点，并给出成熟 tRNA 相对坐标、基因归属与反密码子信息。
分布与 motif
展示 m³C 位点在各类 tRNA 与各结构域的分布，并做 motif 统计，用于判断位点是否集中在特定区域。
差异分析
比较组间在切割信号上的差异，输出差异位点表与可视化结果。
研究应用
- 位点图谱：确定 m³C 在成熟 tRNA 上的分布，含反密码子环相关位点。
- 线粒体相关研究：结合线粒体功能通路分析 m³C 的作用。
- 细胞周期与 DNA 修复：研究 m³C 变化与这些通路的关联。
- 与富集法互验：用化学切割结果复核 IP 法发现的关键位点。
- 多修饰联合：与 m⁷G、m¹A 等方法组合，观察多种修饰在同一批样本中的协同变化。
- 翻译效率研究：把位点变化与翻译组学数据对照，分析解码层面的影响。
常见问题
切割为什么只影响 5′ 片段？
肼-苯胺切割在 m³C 位点断开 RNA 链，产生的 5′ 片段其 3′ 末端受损，无法连接接头，因此在建库中被排除；而 3′ 切割片段与未切割的全长片段可以正常建库。测序结果中两类片段的分布差异，就是判定位点的依据。
假阳性是怎么排除的？
同一批样品分成两组：实验组直接做 HAC 处理，对照组先经去甲基化酶处理再切割（记为 DM-HAC）。修饰被去除后该位点的切割消失，把两组结果相减即可把真正的 m³C 位点从背景中分离出来。
和 m³C-IP-Seq 有什么区别？
HAC 依靠化学反应，不引入抗体偏好，证据独立性强；IP 法依靠抗体富集，对低丰度位点的灵敏度更高。两者互补，常见做法是先用 IP 法筛选，再用 HAC 复核关键位点。
报告包含哪些内容？
包含原始测序数据、位点鉴定与差异分析结果表，以及位点分布与 motif 分析图表。位点表附带成熟 tRNA 相对坐标与结构域归属，便于结合反密码子区域解读。
参考文献
- [1] Zhang F, Yoon K, Zhang DY, et al. Epitranscriptomic regulation of cortical neurogenesis via Mettl8-dependent mitochondrial tRNA m3C modification. Cell Stem Cell 2023;30(3):300-311.e11. DOI: 10.1016/j.stem.2023.01.007. PMID: 36764294
- [2] Xu L, et al. m3C modification of tRNA and its role in translation regulation. (综述，见对应技术文章)