服务优势
- 单核苷酸分辨率：切割断点直接落在修饰位点上，位置判定不依赖富集区间的推断。
- 不依赖抗体：依靠化学反应而非抗体亲和力，避免抗体交叉反应与非特异结合带来的背景。
- 可定量：结合去甲基化对照，把切割信号换算为位点水平的化学计量。
- 覆盖经典与少见位点：可变环等位置的经典 m⁷G 与其他位点一并报告。
- 假阳性可控：以去甲基化处理作为阴性对照，非特异性切割会被扣除。
背景介绍
TRAC-Seq是一种基于还原性切割的 m⁷G 定位方法。样品先经去甲基酶处理以降低背景，随后用 NaBH₄ 与苯胺在 m⁷G 残基处诱导切割；切割产生的片段进入建库流程后被测序捕获，据此判断每个位点是否存在修饰及修饰水平。
m⁷G 在 tRNA 中参与稳定 L 形折叠，并影响反密码子与密码子的配对。位点一旦发生变化，可能改变局部构象，进而影响解码效率。因此在做功能研究之前，先把位点定位清楚很关键。
与依赖抗体富集的策略相比，化学切割路线不引入抗体偏好，对结构紧密的 tRNA 来说更可控——这也是我们把它作为 m⁷G 主力方法的原因。
在小鼠胚胎干细胞中，22 个 tRNA 在可变环的 RAGGU 基序上带有 m⁷G；敲除 Mettl1 后，相应密码子上的核糖体占据上升，细胞周期与脑发育相关基因的翻译受影响最明显。 Lin S, et al. Molecular Cell 2018;71(2):244-255. PMID: 29983320
实验流程
样本质检RNA 完整性与纯度
去甲基化对照两组并行处理
还原性切割NaBH₄ 与苯胺
建库测序捕获切割片段
位点判定信号扣除与定量
生物信息分析
位点鉴定与定量
给出每个 m⁷G 位点在成熟 tRNA 上的相对坐标、tRNA 基因归属、反密码子与 isoacceptor 信息，并给出位点水平的化学计量。
分布与 motif 分析
展示 m⁷G 在各类 tRNA 与各结构域的分布，并做序列 motif 统计，便于观察位点是否集中出现在特定区域。
差异分析
比较组间位点水平的修饰差异，输出差异位点表与可视化结果。
研究应用
- 位点图谱：在转录组范围内确定 m⁷G 位点，包括可变环第 46 位等经典位置。
- 结构与功能：把 m⁷G 变化与 tRNA 稳定性、折叠状态关联起来分析。
- 翻译保真度：研究 m⁷G 水平变化对解码准确性的影响。
- 疾病机制：在肿瘤或代谢模型中筛选差异 m⁷G 位点。
- 方法选择：需要位点水平的 m⁷G 定量时，可与 m7G-Quant-Seq 组合，两条证据链互相印证。
- 多平台组合：与 tRNA 测序、LC-MS 修饰定量组合，形成从表达到底层修饰的完整数据。
常见问题
切割是怎么发生的？
样品先经去甲基酶处理降低背景，随后依次用 NaBH₄ 与苯胺处理，在 m⁷G 残基处诱导还原性切割。切割产生的片段带有可用于连接接头的末端，进入建库流程后被捕获测序，通过读段断点的位置判断修饰位点。
为什么一定要做去甲基化对照？
去甲基化处理会把 m⁷G 转回普通鸟苷，切割随之消失。把处理组与对照组结果相减，可以扣除非特异性切割造成的假阳性，让保留下来的位点更可信。这一步对结果的可解释性影响很大。
和其他 m⁷G 检测策略怎么区分？
TRAC 走的是还原性切割路线；需要位点水平的定量结果时，我们另有 m7G-Quant-Seq 采用靶向化学转化、把 m⁷G 位点记录为逆转录特征。两者证据来源不同，可以按研究目的选择，也可以组合使用互相验证。
报告包含哪些内容？
包含原始测序数据、位点鉴定与定量结果表，以及位点分布、motif 与差异分析图表。位点表中附成熟 tRNA 相对坐标、反密码子与结构域归属，方便直接对照解码相关的结构区域。
参考文献
- [1] Lin S, et al. Mettl1/Wdr4-mediated m7G tRNA methylome is required for normal mRNA translation and embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Mol Cell 71(2), 244-255 (2018). PMID: 29983320
- [2] Zhang LS, et al. Transcriptome-wide mapping of internal N7-methylguanosine methylome in mammalian mRNA. Mol Cell 74(6), 1304-1316 (2019). PMID: 31031084