服务优势
- 亚硫酸氢盐转化：转化条件兼顾转化效率与 tRNA 完整性。
- 位点级定量：C/T 读出比例换算为每个 m⁵C 位点的修饰水平。
- 不依赖抗体：回避抗体对 tRNA 紧密三级结构的捕获偏倚。
- 结构域解析：m⁵C 对 L 形折叠与解码的调控可在位点层面追踪。
- 已知位点覆盖：反密码子环与可变环上的经典 m⁵C 位点与新型位点一并报告。
背景介绍
BS-seq是一种在单碱基分辨率上定位 tRNA m⁵C 的方法：亚硫酸氢盐把未修饰胞苷脱氨为尿嘧啶（测序读作胸腺嘧啶），而 m⁵C 受甲基保护仍读作胞嘧啶，两类信号据此区分。
m⁵C 影响 tRNA 的结构稳定性与解码过程，位点分布在不同结构域上。整体丰度容易掩盖位点之间的差异，这也是需要单碱基分辨率的原因。
做法是经典亚硫酸氢盐思路的延续：未修饰的胞苷被脱氨为尿嘧啶（测序中读作胸腺嘧啶），带甲基保护的 m⁵C 则保持读作胞嘧啶。比对时出现 C 的位点就是候选 m⁵C——转化率越高、背景越干净，位点判定就越可靠，整个过程不依赖抗体。
亚硫酸氢盐处理可以区分未修饰胞嘧啶与 5-甲基胞嘧啶，并给出单链水平的序列信息——这一原理自 1992 年建立以来，一直是 5mC 类修饰单碱基定位的基础。 Frommer M, et al. PNAS 1992;89(5):1827-1831. PMID: 1542678
实验流程
样本质检RNA 完整性与纯度
亚硫酸氢盐转化未修饰 C 转为 U
文库构建单碱基测序文库
高通量测序按项目规模配置
数据分析C/T 比例换算与判定
生物信息分析
位点鉴定与定量
读段比对到精选参考序列后判定 C→T 转化特征，给出每个 m⁵C 位点的化学计量，并标注成熟 tRNA 相对坐标、基因归属、反密码子与结构域。
分布与 motif
汇总 m⁵C 在各类 tRNA 与各结构域上的分布，并做一致性 motif 统计。
交付内容
- 原始 m⁵C tRNA 测序 FASTQ 数据文件，可直接提交至 GEO/SRA 等公共数据库。
- 含 BAM 比对文件与关键比对指标的质控报告。
- 高置信度单碱基 m⁵C 位点表（XLSX），含坐标、反密码子、isoacceptor 与化学计量。
- m⁵C 在 tRNA 各结构域的分布图与一致性 motif 分析图（PDF/PNG）。
- 组间差异修饰位点表（XLSX），含倍数变化等统计信息。
- 兼容基因组浏览器的信号文件（bigWig/bedGraph）及结构化 tRNA 报告。
研究应用
- 化学计量比较：在不同条件或疾病状态下比较保守位点的 m⁵C 比例。
- 结构—功能关联：把位点级 m⁵C 与 tRNA 稳定性、折叠状态关联起来。
- 翻译保真度：将 m⁵C 变化与解码准确性和翻译效率联系起来。
- isoacceptor 比较：比较不同 isoacceptors 与 isodecoders 的 m⁵C 模式。
- 经典位点复核：对反密码子环与可变环上的经典 m⁵C 位点做位点级复核。
- 候选标志物：筛选疾病相关的 tRNA m⁵C 位点作为候选标志物。
常见问题
BS-seq 检测 m⁵C 的核心原理是什么？
亚硫酸氢盐把未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶（读作 T），而 m⁵C 因为带有甲基保护而保持读作 C。比对时出现 C 的位点即为候选 m⁵C，转化率越高、背景越干净，位点判定越可靠。这一原理不依赖抗体，因此不受抗体交叉反应影响。
BS-seq 的结果精确到什么程度？
未修饰胞嘧啶被转化成尿嘧啶、m⁵C 保持读作 C，两者在测序结果里直接区分，因此定位精度落在单个核苷酸上。位点表给出每个位置的 C/T 读出比例，并标注成熟 tRNA 相对坐标、反密码子与结构域。
报告里会给出哪些内容？
包括原始测序数据与比对质控报告、单碱基 m⁵C 位点表（含坐标、反密码子、isoacceptor 与化学计量）、结构域分布与 motif 图、组间差异位点表，以及可加载到基因组浏览器的信号文件。
适合哪些样本类型？
支持 total RNA、细胞、组织与血液等样本。样本采集后建议尽快低温保存、避免反复冻融；具体准备方式可参照送样指南，或寄送前与我们确认。
参考文献
- [1] Frommer M, McDonald LE, Millar DS, et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS 1992;89(5):1827-1831. DOI: 10.1073/pnas.89.5.1827