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为什么研究snoRNAs?

snoRNA 参与 rRNA 修饰、可变剪接、翻译调控与应激反应，并在癌症、Prader-Willi 综合征等疾病中出现表达改变。数谱生物的小 RNA 服务覆盖 tRNA、tRF&tiRNA 的表达定量与修饰检测，可作为同类研究的思路参考。

近期的研究表明，snoRNA 还参与到遗传性疾病、人类的变异、造血、代谢以及癌症的过程中。 参考文献 [3]–[9]
研究速览
本文要点：在人类细胞里，基因表达调控由几块拼图组成：RNA 的转录后修饰、mRNA 的稳定性与翻译控制；snoRNA 及其加工产生的功能短片段恰好嵌在其中——它们指导核糖体 RNA（rRNA）与小核 RNA（snRNA）的修饰，影响互补前体 mRNA 的剪接，并控制 mRNA 的翻译与稳定性。
数谱生物的小 RNA 服务覆盖 tRNA、tRF&tiRNA 的表达定量与修饰检测，可作为同类研究的思路参考。

引言

snoRNA（核仁小 RNA）的长度介于 60–300 nt 之间，属于中等长度的非编码小 RNA。它们需要先与核仁核糖核蛋白结合、组装成 snoRNP 复合物，才能发挥作用 [1]。在脊椎动物中，编码 snoRNA 的基因大多藏在蛋白编码基因或非蛋白编码基因的内含子里，必须经过转录后加工才能变成成熟分子 [2]。rRNA 加工、RNA 剪接与翻译调控、氧化应激反应，是 snoRNA 参与的主要生物学过程 [3]。此外，遗传性疾病 [4]、人类的变异 [5]、造血 [6]、代谢 [7, 8] 和癌症 [3, 9] 中也都出现了与 snoRNA 相关的证据。

snoRNA 的生物合成

snoRNA 分为两个家族：C/D box 与 H/ACA box。绝大多数成员的编码序列位于由 RNA 聚合酶 II 转录的基因的内含子中 [9]；长链非编码 RNA（lncRNA）的内含子同样是来源，例如 GAS5 就携带 9 个不同的 C/D box snoRNA（SNORD74–81）[10]。pre-snoRNA 从内含子上脱离后，还需要核酸外切酶把两端的多余序列切除，才能成为成熟分子。成熟 snoRNA 依靠内部的信号序列招募相应蛋白、形成 snoRNP 复合物，从而避免被酶切并由此行使功能。

snoRNA 的功能

参与核糖体 RNA 的加工。rRNA 加工中有两项修饰依赖 snoRNA：2′-O-甲基化与假尿嘧啶化 [11]。前者由 C/D box snoRNA 负责。这类分子带有两个短序列元件——5′ 端的 box C（RUGAUGA，R 为 A 或 G）与 3′ 端的 box D（CUGA）；多数基因的 5′、3′ 末端还有 4–5 nt 的反向重复序列，能配对形成稳定的短茎，这一结构对 snoRNA 的生物合成与核仁定位都必不可少 [12]。在大部分 C/D box snoRNA 的中部，还能找到与 box C、box D 相似的结构（差异通常只有 1–2 nt），即 box C′ 与 box D′ [13]；被甲基化的核苷酸位置就在 D 盒或 D′ 盒序列上游第 5 个核苷酸处。假尿嘧啶化则主要由 H/ACA box snoRNA 完成，它们的二级结构呈"发夹-铰链-发夹-尾"（hairpin-hinge-hairpin-tail）的保守形状 [13]：box H（ANANNA，N 为任一核苷酸）坐落在单链铰链区，ACA 位于 3′ 末端上游第 3 个核苷酸处。指导序列被包在单个或两个发夹内的"假尿嘧啶化泡"（pseudouridylation pocket）中，能与靶 RNA 上修饰位点两侧各形成 4–8 nt 的配对。另有一类只出现在 Cajal 小体中的特殊成员 SCARNA，专门对剪接体 RNA 做 2′-O-甲基化与假尿嘧啶化 [14]。

充当 miRNA 的前体。越来越多的实验证据表明，snoRNA 可以被进一步加工成更短的片段，而这些片段具有类似 miRNA 的功能，因此 snoRNA 有可能充当 miRNA 的前体 [15]。ACA45 是第一个被报道能降解为短片段 RNA 的 snoRNA，它是在与 Ago 蛋白的相互作用中被发现的；Ago 属于 miRNA RISC 复合物，说明 ACA45 的加工依赖 Dicer。后续实验显示，降解产生的 20–22 nt 片段按 miRNA 的方式抑制目的基因 CDC2L6 的表达 [15]。近年还有报道指出，11 个 C/D box snoRNA 同样能形成短片段 RNA 来抑制靶基因 [16]。

影响可变剪接。除了充当 miRNA 前体，snoRNA 也能调节 RNA 的可变剪接。HBII-52（C/D box snoRNA）上的 18 个核苷酸可与 5-羟色胺受体 5-HT(2C) 的 mRNA 互补配对，通过改变该受体的剪接方式来调控其表达，最终导致 Prader-Willi 综合征 [17]。

参与应激反应。核仁在细胞应对应激时扮演主要角色，各种压力会让核仁发生改变甚至遭到破坏，而 snoRNA 能帮上忙。缺氧条件下，SNORD14A 与 SNORD83B 的表达显著上升 [18]；棕榈酸酯处理则提高 SNORD32A、SNORD33、SNORD35A 的水平——当细胞抑制这三个 snoRNA 的表达后，便对棕榈酸酯产生了抗性，说明它们介导了诱导剂引起的细胞死亡 [7]。snoRNA 出现在细胞质中的时间窗口很窄，仅限于应激反应的早期阶段。以代谢压力的早期为例，SNORD3、SNORD13、SNORD118 三个相互独立的 snoRNA 与各自靶向的 mRNA 在细胞质中互相依存、彼此调节翻译。可见 snoRNA 参与的细胞过程比原先设想的更复杂。

snoRNA 在癌症中的作用

癌症中的分子病理。snoRNA 与癌症的联系最早来自脑膜瘤——与正常脑组织相比，脑膜瘤中 snoRNA 的表达大幅下调 [20]。此后，非小细胞肺癌中多种 snoRNA 被观察到表达状态不一 [21]。snoRNA U50 的 2 bp 纯合缺失突变与前列腺癌的发生发展相关 [22]，在乳腺癌中 U50 则表现出杂合缺失与转录下调 [23]。另有研究把目光放在宿主基因上：snoRNA 与 lncRNA 的宿主基因 GAS5 通过诱导或感受凋亡来调控细胞生存，它在乳腺癌中大幅下调，因此可能是一个抑癌基因 [24]。这条线索还延伸到与 snoRNA 相互作用的蛋白。snoRNP 按结构与功能分为 C/D box 与 H/ACA box 两类：前者的蛋白组成为 fibrillarin（Nop1p）、Nop56、Nop58（Nop5p）和 p15.5KD（Snu13p），都属于进化上保守且必需的成员；后者结合的是 Cbf5p（dyskerin）、Gar1p、Nhp2p 与 Nop10p。fibrillarin 为发育所必需，一旦缺失会造成胚胎致死；Dyskerin、NOP10 与 Nhp2p 的突变则与上皮癌相关 [25]。snoRNA 与 snoRNP 影响肿瘤发生的途径可能有两类：癌细胞中的翻译过程本就异常，可以经由核糖体与蛋白翻译间接起作用；或者靠降解产生的短片段 RNA 扮演 miRNA，直接调节基因表达。至于靶基因尚不明确的"孤儿 snoRNA"，很可能是下一阶段的研究热点。

作为诊断与预后标志物。snoRNA 功能多样，肿瘤中特异表达的成员自然被寄望于生物标志物。研究已经证实 snoRNA 能在血浆和血清中稳定存在并被检测到，因此它具备成为循环肿瘤标志物的潜力 [9]。非小细胞肺癌是一个具体案例：SNORD33、SNORD66 与 SNORD76 既在肿瘤中高表达，也能在血浆中检出高水平，使患者与健康人的区分成为可能 [21]。SNORA42 在组织相关疾病的预后判断上表现一般，但可以用于预测疾病 [26]。近期的成果进一步拉长了这份名单：SNORD43、SNORD44、SNORD48 被报道为乳腺癌与头颈部鳞状细胞癌的潜在抑制剂 [27]；U50 对乳腺癌和前列腺癌有抑制作用 [22, 23]；SNORD113-1 在原发性肝细胞癌中表达下调，并以抑癌基因的身份发挥作用 [28]。综合来看，snoRNA 有资格成为癌症诊断与预后的候选标志物。

作为治疗靶点。snoRNA 在肿瘤中发挥功能的分子机制还谈不上清楚，但它依然是基因干预治疗的理想候选之一，由 snoRNA 介导的基因沉默或许是较好的手段；用 RNAi 选择性沉默致癌 snoRNA 同样可行。以 SNORA42 为例：它在肺癌中高表达，在肺癌细胞中选择性沉默 SNORA42 之后，细胞增殖能力与活力明显下降 [26]。这类实验证据支持把 snoRNA 开发成癌症治疗的潜在靶点。

snoRNA 与其他疾病

snoRNA 与神经退行性疾病的关联也有报道 [29, 30]。多项独立研究把 Prader-Willi 综合征的病因指向 15 号染色体 15q11–q13 区域的缺失，而该区域内含两个家族成员：SNORD115（HBII-52）与 SNORD116（HBII-85）[31]。其中 SNORD115 可能影响大脑中 5-HT2CR 的 mRNA 水平 [17]；真正主导发病的是 SNORD116 的缺失。孕期酒精暴露导致胎儿大脑发育异常时，C/D box snoRNA 的表达也会改变，表现为 SNORD115 上调、SNORD116 下调 [32]，而 SNORD115 水平的波动会引起各类心理与行为畸变，这正是自闭症的典型表现 [33]。病毒感染是另一条线索：感染后细胞内一系列 snoRNA 的表达明显上调 [34]。一方面 snoRNA 可以充当宿主抗病毒反应的调节者，另一方面病毒也能利用 RNA 调控活性来躲避天然免疫，从而完成自身的生命周期 [35]。

总结

在人类细胞里，基因表达调控由几块拼图组成：RNA 的转录后修饰、mRNA 的稳定性与翻译控制；snoRNA 及其加工产生的功能短片段恰好嵌在其中——它们指导核糖体 RNA（rRNA）与小核 RNA（snRNA）的修饰，影响互补前体 mRNA 的剪接，并控制 mRNA 的翻译与稳定性。外界因素与细胞内信号级联一旦改变 snoRNA 的表达水平，细胞层面的生理变化、器官功能障碍乃至疾病就会随之而来。snoRNA 的结构、表达模式与定位都具有调控意义，因而被视为病理诊断的标志物；弄清它们的表达水平与功能机制，也将为人类疾病的诊断与治疗提供新的希望。

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snoRNA 与 tRNA、tRF&tiRNA 同属非编码小 RNA 家族，表达检测与标志物验证的思路也相通。数谱生物的小 RNA 服务集中在 tRNA 方向：tRNA 测序与 tRNA-qPCR用于 tRNA 表达谱的发现与定量，tRF&tiRNA 测序与 tRF&tiRNA qPCR面向 tRNA 衍生片段，LC-MS tRNA 修饰检测与 tRNA 修饰测序用于序列修饰层面的确认。如果课题的关注点在 snoRNA，这些服务的实验与数据分析思路也可以作为方法学参考。