测序已经广泛用于 small RNA 表达分析，但 RNA 修饰对定量结果的影响长期被忽略。
本文要点：要推进 small RNA 表观转录组学，第一步就是能定性、定量地分析 small RNA 上的修饰。
为什么需要专门的方法
要推进 small RNA 表观转录组学，第一步就是能定性、定量地分析 small RNA 上的修饰。但直到不久前，可用的方法还很有限、分析能力也弱。随着微阵列技术路线的创新，具备高通量、高灵敏度、高准确性并能量化修饰化学计量的 small RNA 谱分析才真正走进常规实验室。
四个绕不开的挑战
一、修饰会干扰逆转录，导致定量失真。测序已经广泛用于 small RNA 表达分析，但 RNA 修饰对定量结果的影响长期被忽略。m¹A、m³C、m¹G 等修饰会在建库过程中干扰逆转录，影响 small RNA（尤其是修饰型 small RNA）的精确定量。一个典型现象是：small RNA-seq 结果更偏向检出 18 nt 的 3′-tRF&tiRNA，而 Northern blot 显示更主要的其实是 22 nt 亚型——差别就来自 TΨC 环上的 m¹A 修饰阻碍了逆转录。由于多数 small RNA 测序数据都出自这类建库方式，直接拿来研究修饰可能得到误导性结论。
二、多重 PCR 扩增带来定量偏差。small RNA-seq 需要经过多轮 PCR 扩增，会显著影响定量准确性，因此需要用独立的、正交的方法复核。
三、对起始材料要求高。多数基于测序的修饰研究方法需要大量材料（常 >100 µg 总 RNA），许多样本量有限的课题因此难以开展。
四、RPM 标准化是相对的。small RNA-seq 常用 RPM（每百万 reads 中来源于某基因的 reads 数）表示相对丰度，而 RPM 取决于样本中 small RNA 类群的整体组成：某一个 small RNA 的 RPM 变化会牵动其他所有 small RNA 的 RPM，哪怕它们的绝对表达水平并没有改变。
要在高灵敏度、可准确计量化学计量的标准下鉴定与量化修饰 small RNA 谱，就需要发展不依赖测序的方法来补上这些短板。
一种非测序路线：Small RNA 修饰芯片
Arraystar small RNA 修饰芯片把 small RNA 定量芯片与 RNA 免疫沉淀（RIP）结合起来（图1）：用特异性抗体富集带修饰的 small RNA，再在同一张微阵列上同时检测带修饰与不带修饰的 small RNA，从而判断修饰的调控作用。它覆盖 miRNA、pre-miRNA 与 tRF&tiRNA 等小 RNA 种类，可检测 O⁸G、m⁷G、m⁶A、Ψ、m⁵C 等修饰。
图1. Arraystar small RNA修饰芯片鉴定和定量small RNA转录后修饰，检测的修饰包括O⁸G、m⁷G、m⁶A、Ψ 与 m⁵C 等。其原理主要是使用特异性抗体免疫沉淀富集修饰small RNA，然后使用Arraystar small RNA修饰芯片对其进行鉴定和定量。
相关服务
如需在课题中开展这类筛选，可直接使用我们的 Arraystar Small RNA 修饰芯片技术服务，与 qPCR、测序等正交手段配合使用，兼顾灵敏度与化学计量。