miRStar™ miRNA PCR芯片

• 简介
• 产品优势
• 实验流程
• 分析流程

•        美国Arraystar公司是非编码RNA研究领域的领导者， 近期Arraystar公司发布了创新性的miRStar™癌症特异性microRNA PCR系统，能够帮助客户快速筛选microRNA分子标志物，或是解析microRNA的调控机制和功能。其中，miRStar™癌症特异性microRNA芯片聚焦于血清Oncomir（癌症相关的miRNA）,是microRNA癌症分子标志物的筛选利器；而miRStar™癌症特异性microRNA &靶基因PCR芯片能够同时检测癌症相关的microRNA和它们的靶基因，评估这些microRNA对靶标mRNA的调控活性，从而帮助研究者筛选到癌症中最为核心的功能microRNA分子，并迅速了解其调控机制和功能。

  Aksomics（原康成生物）是Arraystar公司中国地区唯一代理商，独家为您提供Arraystar公司miRStar™ microRNA PCR芯片全程一站式技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，Aksomics的芯片技术服务人员就可为您完成全部实验操作，并提供完整的实验报告。

  
  

  miRStar™癌症特异性microRNA PCR芯片产品列表

  服务	芯片	规格	描述
  miRStar™ Human Cancer Focus microRNA PCR Array Service	Human Cancer Focus microRNA PCR Array	384-well plate	184个血清Oncomir
  miRStar™ Human Cancer Focus microRNA & Target mRNA PCR Array Service	Human Cancer Focus microRNA & Target mRNA PCR Array	384-well plate	184个癌症相关的microRNA + 178个靶基因

  
  

  miRStar™癌症特异性microRNA芯片---聚焦于血清Oncomir,分子标志物筛选利器

         microRNA在癌症等疾病状态下发生显著的表达改变，多年积累的大量研究结果支持microRNA与癌症的密切关系。近年来，研究进一步发现，microRNA在血清，血浆，尿液等临床样品中稳定存在。基于microRNA，特别是血清血浆microRNA 的癌症分子生物学标记物（biomarker）筛选方兴未艾。为了帮助客户筛选microRNA癌症分子标志物，Arraystar公司创新性的开发了miRStar™癌症特异性 microRNA芯片。 miRStar™癌症特异性 microRNA芯片聚焦于血清血浆Oncomir。它涵盖了184个从最新的权威数据库和经典文献中精心收集的，与胃癌﹑肝癌﹑肺癌﹑乳腺癌﹑卵巢癌﹑结直肠癌﹑胰腺癌﹑前列腺癌等常见肿瘤相关的microRNA（Oncomir）。更为重要的是，这些癌症相关的microRNA都在血清样品中经过了严格的测试，证明了其在血清中的稳定存在，因此非常适合于分子标志物的筛选。

  

  *图释：血清microRNA是重要的癌症诊断分子标记物

  
  

• microRNA作为分子生物学标记物的优势

  ● 在血清/血浆，FFPE等临床样品中高度稳定

  ● miRNA表达的呈现出高度的组织/疾病特异性

  ● 单个miRNA往往可以调控数以百计的靶基因，因此只需通过少量的miRNA分子标志物就可相对准确的对疾病进行诊断和预后判断

  ● miRNA是重要的调控分子，不仅可以用作诊断（diagnosis）和预后（prognosis）标志物还可以作为治疗靶点

  
  

  1. 最优的覆盖——对癌症相关的microRNA最全面，最及时的收集

         Arraystar实时的关注各种权威的文献和数据库，并通过严谨的筛选流程从中收集癌症关系最密切的microRNA。miRStar™ 癌症特异性microRNA PCR芯片是市场上对癌症相关的microRNA覆盖最全面、更新最及时、最合理的PCR芯片产品(见下表)。

  癌症类型	miRNA数目
  乳腺癌	157
  胃癌	97
  肺癌	156
  肝癌	113
  卵巢癌	123
  结直肠癌	130
  胰腺癌	139
  前列腺癌	140

  *图释：miRStar™癌症特异性 microRNA PCR芯片覆盖的与特定癌症相关的microRNA数目。

  
  

  2. 验证过的性能——芯片上的所有microRNA引物都在血清样品中验证过

         miRStar™ 癌症特异性microRNA PCR芯片上每条microRNA引物都经过了精心的设计，并且在血清血浆样品中进行了验证（见下图）。预验证的结果既确保了芯片的可靠性，又证实了这些癌症相关的microRNA在血清血浆中的稳定性，进一步预示了其作为癌症分子标志物的可能性。

  

  *图释：在血清样品中，使用miRStar™ 预验证的 hsa-miR-142-3p特异性PCR引物的实时定量PCR扩增曲线（A）和熔解曲线（B）。溶解曲线呈现锐利的单峰，表明了反应具有很高的特异性。

  
  

  3. 同时检测两个样品——样品间技术误差可以忽略不计

         miRStar™癌症特异性 microRNA PCR芯片可以在同一块PCR板上同时检测2个样品，如癌症样品 vs 正常样品或是两个生物学重复，样品间的技术误差几乎可以忽略不计。

  
  

  4. miRStar™癌症特异性microRNA & 靶基因芯片——同时检测microRNA和靶基因,microRNA功能解析利器

         microRNA可以通过碱基互补的方式和靶标mRNA结合，而后降解mRNA沉默基因的表达。一个microRNA 可以调控近百个不同的mRNA分子，另一方面，一个mRNA也能够结合多个不同的microRNA. 由此形成microRNA-靶基因网络调控关系。在癌症研究领域中，microRNA已经成为一个非常重要的部分。不同类型癌症样品具有不同的基因表达模式，因此，即使是相同的microRNA，它们在不同类型的癌症样品中的调控的靶基因往往是不同的。

         传统的microRNA检测平台只检测microRNA的表达状况，不能平行的检测microRNA和靶基因，从而无法全面的了解microRNA-靶基因调控网络。

         Arraystar公司开创性的设计了miRStar™microRNA PCR芯片系统，可以同时检测癌症相关的microRNA和它们的靶基因。它不仅能够快速检测样品中癌症相关的microRNA的表达变化，还可以评估这些microRNA对靶标mRNA的调控活性，从而帮助研究者筛选到疾病中最为核心的功能microRNA分子，并迅速了解其调控机制和功能。

  同时检测癌症相关的microRNA和靶基因

         miRStar™癌症特异性microRNA & 靶基因 PCR芯片包含癌症相关的184个microRNA以及这些microRNA的178个靶标mRNA分子。184个microRNA是从最新的文献中精心筛选，涵盖了与胃癌，肝癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，结直肠癌，胰腺癌，前列腺癌等常见肿瘤相关的microRNA（见下表）。178个靶mRNA有大量的文献支持，其表达水平的变化与肿瘤中microRNA的功能活性改变有关。通过创新性的实验设计（见下图），miRStar™癌症特异性microRNA & 靶基因 PCR芯片实现了对microRNA和 靶mRNA的同时检测，采用高效，优化的实验流程，起始RNA量可低至50ng。

  

  *图释：miRStar™癌症特异性microRNA & 靶基因 PCR芯片包含的microRNA（黄色背景），mRNA（紫色背景）和内参（红色方框。

  

  *图释：miRStar™癌症特异性microRNA & 靶基因PCR芯片工作流程。

  
  

  
  

  
  

• 1.样品RNA抽提

         a.实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。

         b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿TRIzol使用量为1ml），裂解后抽提RNA。

  2.DNase I消化RNA样品

         DNase I在37°C温育处理RNA样品，去除RNA抽提过程中可能混入的基因组DNA。

  3.RNA纯化

         RNeasy MinElute纯化试剂盒（Qiagen）对DNase I处理的RNA样品纯化回收，以得到单纯的RNA样本。

  4.RNA质量检测

         a.使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。

         b.用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。

         c.提供RNA QC报告。

  5.cDNA合成

         按照miRStarTM第一链cDNA合成试剂盒使用说明将样品RNA逆转录为cDNA (oligo dT和miRStarTM microRNA反转引物)。

  6.实时定量PCR

         按照芯片说明将cDNA模板适当稀释后加入到实时定量PCR反应混合液中，然后在含有基因特异性引物的384孔板各孔中加入等量反应液，进行实时定量PCR反应。

  7.数据分析

         利用配套软件计算PCR芯片中的各个基因的Ct值，采用公认的ΔΔCt方法比较基因的表达变化。

         a.计算每个处理组中的每个microRNA和靶基因的ΔCt（microRNA和靶基因分别用各自的内参基因）。

         ΔCt (Ctrl) = average Ct - average of HK genes’Ct for Ctrl array

         ΔCt (Exp) = average Ct - average of HK genes’Ct for Exp array

         b.计算2个PCR Array中每个基因的ΔΔCt。

         ΔΔCt = ΔCt (Exp) - ΔCt (Ctrl)

         c.通过2-ΔΔCt计算Exp（实验组）与Ctrl（对照组）间基因的表达差异。

  8.提供实验报告

         Gene table（PCR板所含的基因列表）

         Excel芯片结果汇总表（包括芯片原始结果、数据分析和各种图表）

  
  

  
  

• Aksomics microRNA PCR芯片数据分析

  1.差异microRNA筛选

         microRNA的qPCR数据展示在“microRNA expression data”数据表格中，表达有差异（>2倍）或有显著性（P<0.05）的数据用有颜色的字体标注，客户可以很方便的根据自身要求，利用倍数变化和P值在列表中筛选差异microRNA，常用筛选标准：倍数变化>2倍，P<0.05。

  

  *图释：差异microRNA筛选示例

  
  

  2. 差异mRNA筛选 (仅适用于miRStar™癌症特异性 microRNA & 靶基因芯片)

         靶mRNA的qPCR数据展示在“mRNA expression data”数据表格中，表达有差异（>2倍）或有显著性（P<0.05）的数据用有颜色的字体标注，客户可以很方便的根据自身要求，利用倍数变化和P值在列表中筛选差异microRNA，常用筛选标准：倍数变化>2倍，P<0.05。

  

  *图释：差异mRNA筛选示例 

  
  

  3. 差异microRNA与靶mRNA的联合分析 (仅适用于miRStar™癌症特异性 microRNA & 靶基因芯片)

          我们还将差异表达的microRNA（一般筛选标准为：倍数变化>=2倍，P<0.05）与其靶mRNA的表达数据进行整合，相应的数据展示在“microRNA-mRNA data”数据表格中。如果microRNA的靶基因与其表达趋势相反，并且也在样品组间呈现出显著性的差异，那么在此类样品中这个靶基因可能是此microRNA真实的靶基因。microRNA与靶mRNA的作用位点，可能的细胞学功能，以及相应的实验证据来源也列在表格中。

  

  *图释： 差异microRNA和靶mRNA的联合分析示例

  
  

  4. 散点图

         客户可以根据散点图直观的看到表达上下调的基因，及其上下调程度

  
  

  

  *图释：散点图示例。位于灰色条带上方的是上调倍数大于2倍的microRNA/mRNA，位于灰色条带下方的是下调倍数大于2倍的microRNA/mRNA

  5. 3D图
         可以直观的了解表达上下调的基因，及其在PCR板上的位置

  

  
  

  *图释：3D图示例。纵轴为基因表达倍数变化，横纵轴分别代表相应基因在PCR板上的位置。