Exiqon microRNA PCR芯片

• 简介
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• 实验流程
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•        Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片检测平台，基于LNA™专利技术，采用独特的Universal RT反应，实现对microRNA的准确定量检测，即使在总RNA含量较低的样本，如FFPE和血清/血浆中，也可以获得高质量的microRNA检测结果。

  数谱生物为您提供Exiqon公司miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片——microRNA实时定量PCR芯片技术服务，全部实验皆使用进口试剂完成，使用的定量PCR仪器为美国应用生物系统公司生产的荧光定量PCR仪ABI PRISM® 7700或ABI PRISM® 7900。PCR芯片技术服务的主要流程包括：抽提、RNA质量检测、cDNA模板制备、实时定量PCR、数据处理及制作实验报告。

  Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片列表
  

  
  

  芯片名称	规格	物种	描述
  microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I	384 well	人	372个常见的人类miRNA
  microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II	384 well	人	752 个人类miRNA
  microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I	384 well	小鼠，大鼠	372个常见的小鼠/大鼠miRNA
  microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I+II	384 well	小鼠，大鼠	752 个小鼠/大鼠miRNA
  Cancer Focus microRNA PCR Panel	96 well	人	84个癌症相关的miRNA
  Serum/Plasma Focus microRNA PCR Panel	384 well	人	179个在血清、血浆样品中验证过的miRNA
  Stem Cell Focus microRNA PCR Panel	96 well	人	85个与胚胎干细胞或多能诱导干细胞相关的miRNA

  
  

  Exiqon的LNA™专利技术攻破MicroRNA PCR检测的两大难题

  1. LNA™化学修饰提高引物和靶标分子的结合力，提高检测灵敏度，解决microRNA引物设计的难点：

         microRNA长度仅22nt左右，相当于一条普通oligo引物的长度，而PCR扩增需要上下游两条引物，因此传统的microRNA的PCR方法仅一条引物为microRNA特异性，另一条采用通用引物，检测的特异性降低。 此外，microRNA的GC含量分布范围广: 5%-95%，由于A :T配对碱基的结合力要低于G :C配对，此GC含量低于50%的microRNA,即使整条序列都被一条普通的oligo引物覆盖，该引物的Tm值参数仍然难以达到PCR检测的要求（55-63℃），这个部分的microRNA用普通引物是不能得到有效扩增。LNA™专利技术能解决microRNA研究的难点，包括PCR检测。每个LNA™修饰位点能够提高引物Tm值3-8℃，因此在相同的PCR反应条件下（引物的Tm值60℃左右），可以通过加入LNA™缩短引物的长度，使得上下游都为microRNA特异性引物，PCR的特异性得到双重保障。而且更为重要的是，GC含量低的microRNA的PCR问题也能迎刃而解，控制加入LNA™的比例(GC含量低的microRNA检测引物加入多个LNA™修饰的碱基)，使所有的microRNA都能得到有效的、均一的检测信号。

  

  图1.左图为LNA™（Locked Nucleic Acid）的化学结构，LNA是一种类寡核苷酸衍生物，提高引物和靶标分子的稳定性，能够增加引物的溶解温度（Tm值）。相同的Tm参数条件下，加入LNA可以缩短引物长度（右图）。

  
  

  2. LNA™专利技术显著提高PCR反应的单碱基分辨能力，区分MicroRNA家族各成员:

         microRNA中存在多个家族（microRNA family）,家族成员间序列相似性极高，个别成员间仅相差一个碱基。普通oligo引物无法分辨单碱基差异，即使有一个碱基错配也能继续PCR反应，因此无法分辨极度相似的家族成员。LNA™修饰的引物具有单碱基分辨能力，其原理如下图所示。ΔTm=Tm(引物/完美匹配的靶标分子)-Tm（引物/单碱基错配靶标分子），加入LNA™后ΔTm值显著增加,PCR交叉反应的可能性大大降低。Tm(LNA引物/单碱基错配)低于PCR反应温度，PCR反应条件下引物和错配分子处于解离单链状态不能进行PCR反应；Tm(LNA引物/完美匹配靶标分子)高于60℃，产生有效的PCR扩增信号。

  
  

  

  图2.左图加入LNA™后ΔTm值显著增加,PCR交叉反应的可能性大大降低。右图，人工合成序列相似的microRNA成员分子，用miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR平台检测。如表所示，交叉反应的信号极低，有些情况下甚至没有。  

  
  

  
  

  
  

  
  

• Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片特点

  1.灵敏度高：

         微量样本，无需预扩增，节省宝贵样本；对RNA量低的样本，如血清、血浆、FFPE、LCM等特殊样本尤其适用；LNA™ PCR系统检测单个microRNA仅需1pg总RNA（图3）；而miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片在仅仅40ng总RNA中就可以检测730种microRNA的表达；LNATM PCR芯片灵敏度是同类芯片的10倍以上。

  2.特异性强：

         经LNATM 优化的PCR引物，可有效区分microRNA间的单碱基差异，并能区分成熟和前体microRNA；同时使背景信号值最小；

  3.准确性高：

         LNATM PCR芯片上的引物均经过了实验验证；反转录采用Universal RT对各种不同的microRNA同时进行反转录，减少技术误差；对AT含量高的microRNA同样有效。

  4.质控严格：

         每个panel均包含6个内参和2组质控对照；基于SYBR green的PCR方法，还可以提供溶解曲线以判断扩增特异性（图4）
  5.高重复性：

         简化实验步骤，减少技术误差，实验重复性好（图5）

  
  Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR 芯片如何实现高通量高质量的microRNA定量检测？

  1.独特的Universal RT反应：
         一次单链cDNA合成反应制备的cDNA可作为芯片所有microRNA PCR反应的模板（图6），减少操作步骤，消除技术误差，节省宝贵样本。同时避免了在芯片中使用混合RT引物对扩增特异性的影响。

  

  图6. Universal RT microRNA PCR反应原理

  
  

  2.基于LNA™专利技术的PCR扩增反应：
         实现引物Tm值均一，并同时保持microRNA扩增的高特异性和高灵敏度：
         miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片中所使用的microRNA特异性的PCR引物（PCR扩增上下游引物）都经过LNA™优化，并且经过严格的验证，能有效区分序列只差一个碱基的microRNA，并能区别成熟microRNA和microRNA前体，从而保证对靶microRNA的特异性扩增；同时，显著降低背景信号，从而增强对低丰度microRNA的准确检测。

  3.严格的芯片内参照和质控设置：
         miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片内设置了6个内参，包括：3个microRNA (hsa-miR-103, hsa-miR-191 and hsa-miR-423-5p)，3个小RNA (U6, SNORD38B and SNORD49A)。这些内参在大量实验结果和多种组织的microRNA表达分析中均呈现出稳定的表达水平，但研究者也需要根据组织或细胞的实际情况选择最合适的、稳定表达的内参分析试验结果。
         同时，芯片内还设置了一个spike-in对照和一组3次重复的芯片间误差校正参照。

  
  

  Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片应用

  1. miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片在LCM微量样本microRNA表达检测中的应用：
         由于miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片要求的样本量较其他平台更少，对于LCM等微量样本尤其适用。（图7）

  

  
  

  2. miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片在血清/血浆的microRNA检测中的应用：

         近年来，microRNA成为来源于血液来源的新生物学标记物，但由于采血量和microRNA分子大小及表达水平等限制，检测血液中的microRNA面临着诸多挑战。

         miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片具有无与伦比的灵敏度和检测特异性，即使对血清/血浆等含微量总RNA的样本，也可实现对microRNA的高质量检测；并且无需对cDNA进行预扩增。（图8）

  
  

  

  
  

  
  

  
  

• 1.样品RNA抽提

         a.实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。

         b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿TRIzol使用量为1ml），裂解后抽提RNA。

  2.RNA质量检测

         a.使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。

         b.用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。

         c.提供RNA QC报告。

  3.cDNA合成

         按照Exiqon逆转录试剂盒使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。

  4.实时定量PCR

         按照芯片说明将cDNA模板适当稀释后加入到实时定量PCR反应混合液中，然后再含有基因特异性引物的96孔板各孔中加入等量反应液，进行实时定量PCR反应。

  5.数据分析

         利用配套软件计算PCR芯片中的各个miRNA的Ct值，采用公认的DDCt方法比较基因的表达变化。

         a.计算每个处理组中的每个miRNA ΔCt。

         ΔCt (Ctrl) = average Ct – average of HK genes’ Ct for Ctrl array

         ΔCt (Exp) = average Ct – average of HK genes’ Ct for Exp array

         b.计算2个PCR Array中每个基因的ΔΔCt。

         ΔΔCt = ΔCt (Exp) - ΔCt (Ctrl)

         c.通过2-ΔΔCt计算Exp（实验组）与Ctrl（对照组）间基因的表达差异。

  6.提供实验报告

         MiRNA table（miRNA列表）
         Excel芯片结果汇总表（包括芯片原始结果、数据分析和各种图表）

  
  

  
  

  
  

• 1.分子标志物筛选

  结肠癌分型marker(Identification of serum microRNA profiles in colon cancer. BJC.2013)

  使用芯片：Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR Panel
         研究者通过比较：1）结肠癌和健康对照，2）早期和晚期结肠癌病人的血清microRNA表达，筛选得到了可以作为早期诊断标记物的21个microRNA。这些microRNA中的一部分与结肠癌组织和细胞水平的研究得到的microRNA有重叠，另外一部分则是在其他癌症中发现的重要的microRNA。由于microRNA的调控是一个复杂的网络，所以采用一组而不是某一个microRNA作为分子标记物会更加可靠。基于此研究成果，还将在更多的临床样本，不同种族的群体中进行microRNA标志物的验证。

  

  
  

  
  

  
  

  2.功能机制研究

  High dose glargine alters the expression profiles of microRNAs in pancreatic cancer cell, 2012, WJG）
         甘精胰岛素（glargine）是临床上用于糖尿病治疗的药物，但与胰腺癌的患病风险风险提高有关，本研究从microRNA分子水平揭示其促癌的分子机制。首先应用Exiqon microRNA Ready- to- use human Panel I检测甘精胰岛素刺激下胰腺癌细胞(SW1990)的microRNA表达谱变化，筛选得到12个表达变化的microRNA其中miR-95的变化倍数最高。而后围绕着miR-95展开的细胞以及动物模型的实验并证明miR-95具有促进癌细胞增殖、转移，以及肿瘤组织生长的作用。

  

  
  

  
  

  
  

• → Mir-449a, a potential diagnostic biomarker for WNT group of medulloblastoma. J NEURO-ONCOL. 2016

  → MiR-28-3p as a potential plasma marker in diagnosis of pulmonary embolism. Thromb Res. 2015

  → Diagnostic value of a plasma microRNA signature in gastric cancer: a microRNA expression analysis. Sci Rep. 2015

  → Identification of Differential MicroRNAs in Cerebrospinal Fluid and Serum of Patients with Major Depressive Disorder. PLoS One. 2015

  → Plasma miR-122 and miR-192 as potential novel biomarkers for the early detection of distant metastasis of gastric cancer. Oncol Rep. 2014

  → Aberrant miRNA profiles associated with chronic benzene poisoning. Exp Mol Pathol. 2014  

  → Serum miR-19a Predicts Resistance to FOLFOX Chemotherapy in Advanced Colorectal Cancer Cases. Asian Pacific journal of cancer prevention. 2013

  → High dose glargine alters the expression profiles of microRNAs in pancreatic cancer cells. World Journal of Gastroenterology. 2012

  → Metformin alters the expression profiles of microRNAs in human pancreatic cancer cells. diabetes research and clinical practice. 2012