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单细胞测序技术服务 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 单细胞全转录组测序 |
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生物分子凝聚体研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 CoIP-MS/AP-MS |
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NGS测序技术服务 DRIPc-seq |
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NGS测序技术服务 环状DNA测序 |
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基因芯片技术服务 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表观转录组学测序服务 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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NGS测序技术服务 DNA（羟）甲基化测序（抗体法） DNA甲酰基胞嘧啶(5fc)修饰测序 DNA 5hmC 测序（化学法） 染色质免疫共沉淀测序 |
PCR技术服务 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖体-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
作者单位：中山大学肿瘤中心
研究背景
结直肠癌（CRC)是世界范围内发生率第三且癌症致死率第二位的疾病。尽管前期研究发现很多分子表达的异常（例如IncRNA等）在结直肠癌肝转移过程发生重要作用，其精确的分子调控机制仍然不为人知。CircRNA是pre-mRNA反向拼接形成的闭合单链RNA。circRNA在多种癌症发生过程具有表达差异，从作用机制上，circRNA可以通过吸附miRNA影响靶mRNA表达、可以影响mRNA的转录或可变剪切、可以编码蛋白发挥作用，具有重要调控功能及作为biomarker的潜力。CircRNA上的m6A修饰分布模式与mRNA有很大区别，但m6A修饰对circRNA的影响未知，circRNA的m6A修饰、circRNA在结直肠癌肝转移中的作用都有待进一步研究。
技术路线
作者运用Arraystar Human CircRNA芯片在结直肠癌肝转移病人的组织和血清中进行高通量筛选，发现circNSUN2表达上调并与预后不良相关。作者在临床97个结直肠癌病人中检测circNSUN2与HMGA2发现两者有较高共表达关系，在20对转移瘤与原位瘤检测发现HMGA2在癌症转移过程表达升高。相关研究成果发表在Nature子刊Nature Communications(IF:11.878)上（芯片实验由康成生物|数据生物提供技术服务）。
图1：上：结直肠癌和癌旁中有拷贝数变异基因位置差异表达circRNA聚类图。下：qPCR验证circNSUN2在不同癌症发展阶段显著上调。
2.circNSUN2功能研究
功能实验发现，In vivo过表达/敲除circNSUN2可以促进/抑制人源移植瘤结直肠癌小鼠模型的肝转移和肺转移；In vitro敲除circNSUN2可以抑制结直肠癌细胞的转移和侵袭。为了深入研究circNSUN2作用机制，作者利用RNA pull down联合质谱分析发现circNSUN2可以结合YTHDC1和IGF2BP2蛋白，利用YTHDC1或IGF2BP2抗体做反向RIP验证发现这两个蛋白也能结合circNSUN2。
图2 功能实验 小鼠活体实验表明敲低circNSUN2显著抑制肝转移，右图，免疫组化敲低circNSUN2显著抑制肝转移。
3.CircNSUN2机制研究
为了研究circNSUN2的机制，作者通过RNA pull down-MS实验找到circNSUN2相互作用的蛋白，其中包含m6A的两个识别蛋白，YTHDC1和IGF2BP2。前期研究发现YTHDC1可以促进m6A修饰的mRNA有细胞核转运到细胞质，作者利用分离核质RNA及FISH定位实验发现，circNSUN2核质都分布，胞质含量高，敲除YTHDC1后circNSUN2核内滞留增加，回复WT YTHDC1促进circNSUN1向胞质转运，证明YTHDC1结合m6A修饰的circNSUN2促进其胞质转运过程。
由于IGF2BP2是已知结合mRNA促进其稳定性的蛋白，作者推测该环状可能与IGF2BP2共同促进下游某些mRNA稳定。敲除circNSUN2前后做RNAseq，发现644个mRNA表达下调；利用数据库IGF2BP2的CLIP-seq结果找其结合的mRNA与644个mRNA取交集，发现22个mRNA既能结合IGF2BP2又能受circNSUN2调控，通过qRT-PCR和WB验证，确定HMGA2 mRNA与前期筛选趋势相符，已知该基因可以促进上皮间质转化（EMT）来促进结直肠癌进程，作者再通过RNA pull down、luciferase实验、FISH验证HMGA2 mRNA和circNSUN2可以直接结合，因此circNSUN2与IGF2BP2共同结合HMGA2 mRNA促进其稳定性。
图3：上左circNSUN2的RNA pull down的银染图；上右，IGF2BP2的RIP-circNSUN2-qPCR；下左，敲低YTHDC1的胞质/胞核qPCR检测circNSUN2的定位；下右：过表达/敲低circNSUN2，IGF2BP2-RIP-qPCR发现circNSUN2与HMGA2的相互作用结合。
文章结论
circNSUN2通常在结直肠癌肝转移病人的组织和血清中表达上调并与预后不良相关；
circNSUN2可作为疾病诊断的biomarker及治疗的潜在靶点；
circNSUN2上调可促进小最结直肠癌的肝转移；
circNSUN2的m6A修饰促进circRNA运输到细胞质，进而形成circNSUN2/HMGA2 mRNA/IGF2BP2复合物增加HMGA mRNA稳定性，促进结直肠癌转移过程。
文章链接：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6795808/
相关技术服务
Arraystar m6A-mRNA&lncRNA表观转录组芯片
