表观转录组学测序服务

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• 康成生物|数谱生物表观转录组学测序通过RNA免疫沉淀测序（RNA-IP-Seq）分析定量检测表观转录组m6A, m1A, m5C, ac4C, m7G和Ψ修饰的情况。
  

  
  

  技术优势：

  ●精湛的专业知识：在DNA/RNA修饰分析方面拥有数十年开发经验和技能。
  ●无限的检测范围：涵盖转录本任何区域中的m6A, m1A, m5C, ac4C, m7G和Ψ修饰位点。
  ●高分辨率：在修饰位点的 100 个碱基内精确定位峰值。
  ●高精确度：通过Input对照中的转录本丰度进行表观修饰水平的校准。

  ●严格的质量控制：通过qPCR 验证IP的优越富集效率。

  ●高分文章准备就绪：丰富的生信分析内容，包括修饰差异统计分析、修饰peak峰分布、motif识别等。
  

• m1A（1-甲基腺嘌呤）是一种新发现的mRNA和 lncRNA修饰[1-3]，它可以基于Watson-Crick配对方式上的错误破坏性地影响RNA二级结构和蛋白质-RNA的相互作用[1, 2]。在酶促作用下，mRNA 上的m1A由TRM6-TRM61复合物催化，但这只占 mRNA 上发现的修饰的一小部分[1, 3]。在YTH这种m6A reader蛋白家族中，YTHDF2 被认为是细胞中潜在的 m1A reader，可介导破坏含m1A修饰的RNA稳定性[4]。另外的研究还表明，YTHDF3也可与某些m1A甲基化转录本结合，尤其是IGF1R（胰岛素样生长因子1受体），从而抑制滋养层细胞的侵袭 [5]。ALKBH3是唯一已知的 mRNA m1A 修饰eraser[6]。m1A修饰失调与许多疾病有关。例如， CSF1 (集落刺激因子1) mRNA的m1A去除促进其mRNA的稳定性，被认为可维持乳腺癌和卵巢癌的侵袭性[6]；Aurora A mRNA的ALKBH3依赖性m1A去甲基化可抑制纤毛的生成[7]；在胃肠癌中，ErbB和mTOR 通路中的ErbB2、mTOR和AKT1S1中枢基因被发现受m1A 调节 [8]。另外，m1A 还被证明在应激诱导的肉芽形成过程中具有保护作用[9]。

  
  

  m1A研究参考文献：

  1. Safra M et al: The m1A landscape on cytosolic and mitochondrial mRNA at single-base resolution. Nature 2017, 551(7679):251-255.[PMID: 29072297]
  2. Li X et al: Base-Resolution Mapping Reveals Distinct m(1)A Methylome in Nuclear- and Mitochondrial-Encoded Transcripts. Mol Cell 2017, 68(5):993-1005 e1009.[PMID: 29107537]
  3. Dominissini D et al: The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature 2016, 530(7591):441-446.[PMID: 26863196]
  4. Seo KW, Kleiner RE: YTHDF2 Recognition of N(1)-Methyladenosine (m(1)A)-Modified RNA Is Associated with Transcript Destabilization. ACS Chem Biol 2020, 15(1):132-139.[PMID: 31815430]
  5. Zheng Q et al: Cytoplasmic m(1)A reader YTHDF3 inhibits trophoblast invasion by downregulation of m(1)A-methylated IGF1R. Cell Discov 2020, 6:12.[PMID: 32194978]
  6. Woo HH, Chambers SK: Human ALKBH3-induced m(1)A demethylation increases the CSF-1 mRNA stability in breast and ovarian cancer cells. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech 2019, 1862(1):35-46.[PMID: 30342176]
  7. Kuang W et al: ALKBH3-dependent m(1)A demethylation of Aurora A mRNA inhibits ciliogenesis. Cell Discov 2022, 8(1):25.[PMID: 35277482]
  8. Zhao Y et al: m1A Regulated Genes Modulate PI3K/AKT/mTOR and ErbB Pathways in Gastrointestinal Cancer. Transl Oncol 2019, 12(10):1323-1333.[PMID: 31352195]
  9. Alriquet M et al: The protective role of m1A during stress-induced granulation. J Mol Cell Biol 2021, 12(11):870-880.[PMID: 32462207]

• 虽然 m5C（5-甲基胞嘧啶） 在各种各样的非编码 RNA 中早已存在，但它在编码 RNA 中的存在直到最近才被证实[1, 2]。NSUN2 [3]和NSUN6[4, 5] 将这种修饰添加在 mRNA 上，TET2 作为eraser蛋白将m5C氧化为hm5C[6]。m5C有两种可能的reader蛋白：ALYREF能够促进甲基化 mRNA从细胞核输出，YBX1可以稳定带有m5C修饰的 mRNA [7, 8]。m5C mRNA 修饰具有多种重要的生物学功能，包括作为DNA损伤信号来调节DNA修复[9]、参与干细胞分化[2]、促进母体向合子转变[8]，以及通过促进脂肪生成控制细胞周期进程[10]。此外，也有研究表明m5C与膀胱癌的发病机制[7]和病原体感染诱导的骨髓细胞生成[6]等疾病有关。

  
  

  m5C研究参考文献：
  1. Huber SM et al: Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. Chembiochem 2015, 16(5):752-755.[PMID: 25676849]
  2. Amort T et al: Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biol 2017, 18(1):1.[PMID: 28077169]
  3. Yang X et al: 5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m(5)C reader. Cell Res 2017, 27(5):606-625.[PMID: 28418038]
  4. Liu J et al: Sequence- and structure-selective mRNA m(5)C methylation by NSUN6 in animals. Natl Sci Rev 2021, 8(6):nwaa273.[PMID: 34691665]
  5. Selmi T et al: Sequence- and structure-specific cytosine-5 mRNA methylation by NSUN6. Nucleic Acids Res 2021, 49(2):1006-1022.[PMID: 33330931]
  6. Shen Q et al: Tet2 promotes pathogen infection-induced myelopoiesis through mRNA oxidation. Nature 2018, 554(7690):123-127.[PMID: 29364877]
  7. Chen X et al: 5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nat Cell Biol 2019, 21(8):978-990.[PMID: 31358969]
  8. Yang Y et al: RNA 5-Methylcytosine Facilitates the Maternal-to-Zygotic Transition by Preventing Maternal mRNA Decay. Mol Cell 2019, 75(6):1188-1202 e1111.[PMID: 31399345]
  9. Chen H et al: m(5)C modification of mRNA serves a DNA damage code to promote homologous recombination. Nat Commun 2020, 11(1):2834.[PMID: 32503981]
  10. Liu Y et al: mRNA m5C controls adipogenesis by promoting CDKN1A mRNA export and translation. RNA Biol 2021, 18(sup2):711-721.[PMID: 34570675]

• N7-甲基鸟嘌呤(m7G)是真核生物mRNA 5'帽子上带正电荷的重要修饰[1]，有助于介导翻译、剪接和核输出过程并防止降解。除了经典底物tRNA [4-7]和18S rRNA [8]之外，m7G还在存在于mRNA [2]和miRNA [3]内部，这些m7G修饰都由异二聚体METTL1-WDR4介导添加在哺乳动物的RNA中。mRNA内部的m7G修饰可以提高翻译效率[2]，并且在H2O2和热休克处理下受到动态调节，在CDS和3' -UTR区域显著积累[9]。miRNA m7G修饰被认为可以通过破坏几种初始miRNA (pri-miRNA) 转录产物中G-四联体的抑制性二级结构来激活和促进miRNA加工过程，并参与抑制肺癌细胞迁移[3]。总之，METTL1/WDR4介导的m7G tRNA甲基化是正常mRNA翻译和胚胎干细胞自我更新和分化所必需的[4]，并促进癌症中致癌mRNA的翻译 [5-7]，并且人类18S rRNA 1639 位的m7G修饰也与晚期核rRNA前体加工和 40S 核糖体亚基的生物合成相关[10]。

  
  

  m7G研究参考文献：
  1. Ramanathan A, Robb GB, Chan SH: mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res 2016, 44(16):7511-7526.[PMID: 27317694]
  2. Zhang LS et al: Transcriptome-wide Mapping of Internal N(7)-Methylguanosine Methylome in Mammalian mRNA. Mol Cell 2019, 74(6):1304-1316 e1308.[PMID: 31031084]
  3. Pandolfini L et al: METTL1 Promotes let-7 MicroRNA Processing via m7G Methylation. Mol Cell 2019, 74(6):1278-1290 e1279.[PMID: 31031083]
  4. Lin S et al: Mettl1/Wdr4-Mediated m(7)G tRNA Methylome Is Required for Normal mRNA Translation and Embryonic Stem Cell Self-Renewal and Differentiation. Mol Cell 2018, 71(2):244-255 e245.[PMID: 29983320]
  5. Orellana EA et al: METTL1-mediated m(7)G modification of Arg-TCT tRNA drives oncogenic transformation. Mol Cell 2021, 81(16):3323-3338 e3314.[PMID: 34352207]
  6. Ma J et al: METTL1/WDR4-mediated m(7)G tRNA modifications and m(7)G codon usage promote mRNA translation and lung cancer progression. Mol Ther 2021, 29(12):3422-3435.[PMID: 34371184]
  7. Dai Z et al: N(7)-Methylguanosine tRNA modification enhances oncogenic mRNA translation and promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression. Mol Cell 2021, 81(16):3339-3355 e3338.[PMID: 34352206]
  8. Sloan KE et al: Tuning the ribosome: The influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol 2017, 14(9):1138-1152.[PMID: 27911188]
  9. Malbec L et al: Dynamic methylome of internal mRNA N(7)-methylguanosine and its regulatory role in translation. Cell Res 2019, 29(11):927-941.[PMID: 31520064]
  10. Ounap K, Kasper L, Kurg A, Kurg R: The human WBSCR22 protein is involved in the biogenesis of the 40S ribosomal subunits in mammalian cells. PLoS One 2013, 8(9):e75686.[PMID: 24086612]

• N4-乙酰胞嘧啶（N4-acetylcytidine, ac4C）是一种经典的rRNA和 tRNA 修饰，最近在mRNA 中也有发现[1]。NAT10是目前已知细胞中能够添加ac4C修饰的一种乙酰转移酶[1]，ac4C峰的分布特点是：3'-UTR内的富集峰总体较少，而CDS和5'-UTR内的富集峰较多，且集中在翻译起始位点附近[1]。ac4C可稳定mRNA并促进翻译[1]，特别是位于密码子摆动位点的 ac4C 可提高翻译效率[1]。mRNA乙酰化的生物功能和与疾病的关联在很大程度上仍然未知。有研究认为，依赖于NAT10的ac4C沉积在HIV-1 RNA上会增强病毒RNA的稳定性，从而促进HIV-1复制[2]。最近的一项研究表明，ac4C通过选择性招募PCBP2到IRES来增加 RNA 的稳定性，并促进RNA聚合酶与病毒RNA的结合，从而增强了肠道病毒 71（EV71）RNA 的复制和致病性[3]。

  
  

  ac4C研究参考文献：
  1. Arango D et al: Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell 2018, 175(7):1872-1886 e1824.[PMID: 30449621]
  2. Tsai K et al: Acetylation of Cytidine Residues Boosts HIV-1 Gene Expression by Increasing Viral RNA Stability. Cell Host Microbe 2020, 28(2):306-312 e306.[PMID: 32533923]
  3. Hao H et al: N4-acetylcytidine regulates the replication and pathogenicity of enterovirus 71. Nucleic Acids Res 2022.[PMID: 35971620]

• 假尿嘧啶ψ是人类细胞中目前发现最丰富的RNA修饰，它存在于大多数类型的RNA中，例如mRNA[1, 2]上的假尿嘧啶化主要由PUS1 [3]、PUS7[4]和 TRUB1[4] 等酶完成，并且，有研究证明TRUB2和 RPUSD3参与线粒体mRNA中特定碱基的假尿嘧啶化[5]。mRNA编码区的ψ可通过促进含有ψ的密码子上氨基酸的替换来改变翻译产物[6]。RNA假尿嘧啶修饰以共转录的方式添加在前体mRNA（pre-mRNA）上，并可能影响pre-mRNA的可变剪接，使其富集于可变剪接区[7]。有趣的是，有研究在酵母中发现，同一个假尿嘧啶合成酶Pus6或许可以同时将ψ添加在mRNA和tRNA上，并由MetRS（蛋氨酸氨基酰tRNA合成酶）共同读取，这可能导致全局性和基因特异性翻译反应之间的协调[8]。另外还有一些研究表明，干扰素IFN可诱导干扰素刺激的基因转录本发生Ψ修饰，这表明Ψ在IFN信号通路和病毒防御中发挥作用 [9]。

  
  

  Ψ研究参考文献：

  1. Carlile TM et al: Pseudouridine profiling reveals regulated mRNA pseudouridylation in yeast and human cells. Nature 2014, 515(7525):143-146.[PMID: 25192136]
  2. Schwartz S et al: Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell 2014, 159(1):148-162.[PMID: 25219674]
  3. Carlile TM et al: mRNA structure determines modification by pseudouridine synthase 1. Nat Chem Biol 2019, 15(10):966-974.[PMID: 31477916]
  4. Safra M et al: TRUB1 is the predominant pseudouridine synthase acting on mammalian mRNA via a predictable and conserved code. Genome Res 2017, 27(3):393-406.[PMID: 28073919]
  5. Antonicka H et al: A pseudouridine synthase module is essential for mitochondrial protein synthesis and cell viability. EMBO Rep 2017, 18(1):28-38.[PMID: 27974379]
  6. Eyler DE et al: Pseudouridinylation of mRNA coding sequences alters translation. Proc Natl Acad Sci U S A 2019, 116(46):23068-23074.[PMID: 31672910]
  7. Martinez NM et al: Pseudouridine synthases modify human pre-mRNA co-transcriptionally and affect pre-mRNA processing. Mol Cell 2022, 82(3):645-659 e649.[PMID: 35051350]
  8. Huang S et al: Interferon inducible pseudouridine modification in human mRNA by quantitative nanopore profiling. Genome Biol 2021, 22(1):330.[PMID: 34872593]

• 转录本的RNA修饰水平定量统计：

  

  
  

  RNA表观修饰在转录组中的peak分布：

  

  图1：human ADAR1和UBE2Q1 mRNA中的修饰peak通过基因组浏览器中提供的track文件进行可视化展示。

  
  

  RNA修饰峰reads数目在mRNA各种区域的分布情况：

  
  

  图2：mRNA 的 5'UTR、CDS 和 3'UTR 区域的RNA修饰峰统计(a)和密度分布(b)。

  
  

  RNA 修饰peak序列的motif分析：

  

  图3：用 DREME 算法识别出RNA表观修饰测序的motif，并以序列图表示。

  
  

• 样本需求 ：

  纯化的total RNA，冷冻组织或细胞沉淀；
  有关如何启动项目的详细信息，请参阅样本采集指南。

  
  

  1.总 RNA 分离纯化（可选）；
  2.从总 RNA 中进行 RNA QC 和 mRNA 分离；
  3.mRNA 片段化处理；
  4.用相应修饰的抗体进行IP；
  5.通过 qPCR 进行 IP 效率质控；
  6.测序文库制备；
  7.簇生成；
  8.利用Illumina平台测序；
  9.数据分析，包括reads比对、peak鉴定、peak定量分析和注释、motif分析、差异m1A修饰峰值分析、GO和Pathway分析。