《Molecular Cancer》|m6A-circRNA表观转录组芯片助力胃癌进展功能研究

尽管全球范围内胃癌(GC)的发病率和死亡率呈下降趋势,但GC仍然是中国癌症相关死亡的第三大原因。近几十年见证了胃癌治疗的巨大进步,包括内镜切除、靶向治疗和免疫治疗 。但是,由于肿瘤的侵袭和转移,晚期患者的预后仍然很差。因此,了解肿瘤发生的分子机制对于胃癌的早期诊断和治疗具有重要意义。

M6A是真核生物RNA常见的化学修饰,m6A介导的ncRNA修饰与癌症有关。Mettl14m6A的修饰酶复合物组分,而Mettl14介导的ncRNA m6A修饰与胃癌及的关系有待进一步研究。此次研究探索了Mettl14介导的m6A修饰的circORC5在胃癌进展中的功能机制,研究成果于20222月发表在国际著名学术期刊《Molecular Cancer》(IF: 27.0401)上。(m6A-circRNA表观转录组芯片由康成生物丨数谱生物提供技术服务)。


预实验

为了研究 Mettl14 在胃癌中的潜在作用,首先分析了来自TCGARNA-seq数据和免疫组织芯片的Mettl14的表达,结果显示人类胃癌组织样本中Mettl14的表达相对于正常组织降低,其低表达是胃癌患者生存率低的预后因素。

高通量筛选

为了研究METTL14下游的靶基因,作者在胃癌细胞中敲低了Mettl14,通过Arrraystar Human m6A-circRNA表观转录组芯片筛选到898circRNA具有m6A水平改变(FC>2, P<0.05)。MeRIP-qPCRqPCR实验证实Mettl14的沉默降低了circORC5 m6A水平,但增加 circORC5 表达。因此将circORC5 鉴定为 Mettl14的下游靶标。

功能研究

Mettl14的过表达显著抑制了胃癌的生长和侵袭,而Mettl14的敲低则促进胃癌细胞的增殖和侵袭,敲低Mettl14的同时敲低circORC5,胃癌细胞的增殖和侵袭重新被抑制,说明circORC5Mettl14调控。

机制研究

通过生信预测,circORC5可以结合miR-30c-2-3p。通过Ago-RIP-qPCR实验发现Ago蛋白结合circORC5 miR-30c-2-3p。双荧光素酶报告基因实验证实circORC5可以结合miR-30c-2-3p。敲除circORC5促进miR-30c-2-3p表达,导致其靶基因AKT1S1 EIF4B 下调。敲除circORC5同时敲除Mettl14抑制miR-30c-2-3p 上调,说明Mettl14circORC5上游的负调控因素。

结论

 Mettl14上调circORC5m6A修饰水平进而抑制circORC5表达,进而导致miR-30c-2-3p上调及其靶基因AKT1S1 EIF4B 下调最终影响胃癌进展。


技术路线


结果展示

1. 预实验发现Mettl14与胃癌相关。左上:TCGA数据库分析Mettl14在胃癌中显著降低。右上:KM生存曲线分析Mettl14降低,胃癌的生存期显著下降。左下:敲低Mettl14显著促进胃癌细胞MGC803的增殖。右下:胃癌细胞过表达Mettl14的裸鼠成瘤实验证实敲低Mettl14显著抑制胃癌的体积。

2. Arrraystar Human m6A-circRNA epitranscriptomic芯片筛选到circORC5

左:通过Arrraystar Human m6A-circRNA epitranscriptomic芯片筛选差异m6a修饰的circRNA结果聚类图。中:MeRIP-qPCR结果显示circrnam6A甲基化水平显著降低。右:qPCR显示敲低Mettl14发现circORC5在胃癌中表达水平显著升高。

3. 左上:circORC5 miR-30c-2-3p 之间潜在结合位点的示意图。右上:用 miR-30c-2-3p 模拟物转染 MGC-803 AGS 细胞后 WT luc-circORC5 Mut luc-circORC5 的荧光素酶活性。左下:Ago2-RIP-qPCR 用于检测 circORC5 miR-30c-2-3p MGC-803 细胞中的可以结合。右下:用 si-METTL14 和(或)si-circORC5 转染对 MGC-803 AGS 细胞中 AKT1S1 EIF4B 表达影响的蛋白质印迹分析。

4. 胃癌中 METTL14 的研究思路示意图。METTL14 增加 circORC5 m6A水平并抑制 circORC5表达,从而上调 miR-30c-2-3p 并下调其靶基因AKT1S1EIF4AB,有助于抑制胃癌的发生发展



文章链接:

     https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01521-z