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单细胞测序技术服务 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 单细胞全转录组测序 |
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生物分子凝聚体研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 CoIP-MS/AP-MS |
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NGS测序技术服务 DRIPc-seq |
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NGS测序技术服务 环状DNA测序 |
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基因芯片技术服务 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表观转录组学测序服务 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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NGS测序技术服务 DNA（羟）甲基化测序（抗体法） DNA甲酰基胞嘧啶(5fc)修饰测序 DNA 5hmC 测序（化学法） 染色质免疫共沉淀测序 |
PCR技术服务 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖体-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
——Arraystar表观转录组芯片客户成果——
pre-miR-320/RUNX2的m6A修饰调控骨髓来源间质干细胞的成骨潜力
作者单位：哈尔滨医科大学附属第一医院、哈尔滨医科大学附属第二医院、哈尔滨医科大学
研究团队利用Arraystar Mouse mRNA&lncRNA表观转录组芯片发现RUNX2与pre-miR-320的m6A修饰受到METTL3的调控。在骨质疏松临床病例与小鼠模型中和间充质干细胞（BMSCs）分化为成骨细胞前，METTL3显著下调。小鼠体内实验证实，过表达METTL3，可以增加骨质，促进骨的形成。机制研究发现，METTL3通过调控骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）中的m6A修饰水平，诱导成骨细胞分化，促进骨的形成。该研究成果发表在学术期刊Molecular Therapy Nucleic Acids上（IF:5.91）(芯片实验由康成生物丨数谱生物提供技术服务)。
研究背景：
m6A修饰是mRNA和ncRNA中丰度最高的化学修饰，m6A转移酶复合体的主要成分有METTL3、METTL14和WTAP等，去甲基化酶包括FTO和ALKBH5。并且在多种疾病中都已发现m6A相关酶可以调控疾病的发生发展，m6A修饰本身也可以调控RNA稳定性、RNA结合蛋白、翻译、RNA核质分配等多种过程。
如今，在基础研究与临床应用领域，干细胞疗法已有极大的进展，尤其是骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）疗法已有多篇文章报道，BMSCs可以分化成骨细胞，调控骨代谢平衡。因此研究m6A修饰是否能影响骨分化相关基因的稳定性与翻译效率具有极大意义。
研究思路：
文章着重于研究m6A修饰及m6A修饰转移酶METTL3在骨质疏松和BMSCs分化成骨细胞中的功能与机制，运用Arraystar Mouse mRNA&lncRNA表观转录组芯片检测在敲低METTL3的BMSCs细胞中，显著差异的m6A修饰百分比的指标。通过差异倍数（FC值）＞1.2进行筛选后，挑选了pre-miR-320与RUNX2进行MeRIP-PCR验证。
首先，为了证明m6A修饰在骨质疏松进展过程中具有研究意义，作者发现骨质疏松临床样本与小鼠模型中，m6A修饰的整体水平与甲基转移酶复合体蛋白METTL3与METTL14显著下调。在骨质疏松模型中过表达METTL3，可以显著增加骨密度、骨小梁数目、骨小梁厚度和平均骨体积。在BMSCs中过表达METTL3可以促进BMSCs向成骨细胞的分化；敲低METTL3则抑制BMSCs的分化，证明METTL3在骨形成过程中发挥重要作用。
而后，为了研究METTL3调控BMSCs分化为成骨细胞的作用机制，作者构建了METTL3敲低的BSMCs细胞系，进行了m6A修饰转录本的高通量筛选。经过MeRIP-PCR与qPCR验证发现RUNX2和pre-miR-320的m6A修饰水平产生差异，并且调控了RUNX2与pre-miR-320的稳定性，降低了BMSCs的成骨分化能力。序列分析发现mmu-miR-320可以靶向RUNX2 mRNA，促进RUNX2的降解。因此METTL3可以通过上调pre-miR-320的m6A修饰促进pre-miR-320的降解，下调成熟体mmu-miR-320的丰度，从而导致RUNX2上调；也可以直接调控RUNX2的m6A甲基化修饰，促进RUNX2的稳定性，从而影响BMSCs细胞的分化能力。
技术路线：
结果展示：
图1. 骨质疏松病人中m6A修饰和METTL3表达量降低。A. 骨质疏松病人中m6A修饰水平降低；B. m6A修饰水平统计图；C. 骨质疏松病人中METTL3表达量下调；D. 骨质疏松病人中METTL14表达量下调。
图2. 体内过表达/敲低METTL3影响骨形成。A. 过表达METTL3促进骨形成；B. 敲低METTL3抑制骨质疏松模型小鼠的骨形成。
图3. 敲低METTL3进行m6A修饰的高通量筛选。A. 鉴定METTL3靶基因的高通量筛选流程图；B. 高通量筛选数据分析方式；C. 差异修饰的基因散点图。
图4. RUNX2的差异表达同时受miR-320与METTL3的调控。A. MeRIP-PCR证明pre-miR-320发生m6A修饰；B. 过表达METTL3降低pre-miR-320的稳定性；C. MeRIP-PCR证明RUNX2发生m6A修饰；D. 过表达METTL3促进RUNX2的稳定性；E. 敲低YTHDF1降低RUNX2的稳定性；F. 过表达miR-320降低RUNX2的表达量。
研究意义：
本研究利用Arraystar Mouse mRNA&lncRNA表观转录组学芯片研究m6A修饰在骨髓间质干细胞(BMSCs)分化为成骨细胞中的功能与机制，证实了调控BMSCs中m6A修饰程度可以促进BMSCs的分化能力。相比于正常组织，骨质疏松病人与小鼠模型中，m6A修饰与METTL3的表达量都处于下调的状态。过表达METTL3可以促进小鼠骨骼的形成；敲低METTL3，抑制BMSCs分化成为成骨细胞的相关基因的表达。MeRIP等实验证实METTL3可以通过调控pre-miR-320和RUNX2的m6A修饰调控RUNX2的丰度。一方面，m6A修饰促进pre-miR-320的降解，使得miR-320丰度降低，促进RUNX2的表达；另一方面，RUNX2的m6A修饰可以促进RUNX2的稳定性，最终影响BMSCs的分化。
原文出处：
康成生物丨数谱生物国内独家提供Arraystar表观转录组芯片技术服务
· 覆盖编码基因和非编码基因的表观转录组
（1）mRNA&lncRNA 表观转录组芯片：适用于mRNA、lncRNA、pre-miRNA, pri-miRNA, snoRNA, 和 snRNA；
（2）CircRNA 表观转录组芯片：适用于环状RNA m6A检测
· 准确定量转录本修饰百分比：双通道芯片不仅能对m6A修饰进行定量，还能检测每个转录本修饰亚群和非修饰亚群的百分比
· 转录本特异性检测：使用外显子和跨剪接位点特异性探针
· RNA起始量低至1ug，适用于各类样本
