microRNA 芯片

• 简介
• 芯片特点
• 实验流程
• 结果展示
• 结果实例
• SCI成果

•        microRNA（miRNA）属于small ncRNA，是单链的短RNA，长度在22nt左右。miRNA是基因表达的主要调节分子。miRNA以序列互补的方式与特异靶mRNA结合，通过降解靶mRNA或抑制其蛋白翻译调控靶基因的表达。microRNA不但在基本的生物过程，如发育、应激反应、代谢和基因组完整性维持等方面有基本而重要的调控作用；在疾病的发生发展全过程中，也发挥重要的调控作用。
         Exiqon公司基于LNA（锁核酸）专利技术开发出的microRNA研究系列技术平台，为完整而系统的研究microRNA提供全面支持，在microRNA研究领域赢得了良好的声誉和权威性的地位，包括microRNA表达谱芯片，microRNA PCR芯片，microRNA PCR引物，ISH探针，Northern blotting探针，microRNA inhibitor等等。尤其是LNATM microRNA表达谱芯片，使用了基于LNA™专利技术的捕获探针，表现出同类产品无可比拟的优异品质，在microRNA表达分析领域具有国际领先地位。多年来，全球生物学家使用Exiqon miRCURY LNA™芯片发表了大量文章。
         康成独家提供Exqion microRNA芯片全程技术服务已超过十年，实验系统稳定可靠，并且拥有丰富的实验经验，采用康成技术服务发表的SCI论文已超过100篇，平均影响因子在5.5分以上。

  康成生物为您提供miRNA表达谱芯片技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，康成的芯片技术服务人员就可为您完成全部实验操作，包括：RNA抽提，QC，RNA标记，芯片杂交，数据分析等，并提供完整的实验报告。同时，根据您的研究需要，康成还提供多平台联合分析、分子标志物筛选分析等深入数据分析服务。

  Exiqon公司microRNA芯片

  芯片名称	种属	检测数据	Database Source
  miRCURY LNA™ microRNA Array  7th gen - hsa, mmu&rno	人， 大鼠， 小鼠	3100	覆盖miRBase 数据库人，小鼠，大鼠三物种全部microRNA；覆盖与上述 三物种相关的所有病毒的microRNA

• ● Tm值均一化（72℃），所有microRNA杂交温度一致，保证对所有靶点具有相同的亲和活性（图示）

   

  *图释：通过调整探针中LNA碱基的含量，使不同miRNA探针的Tm值都在72度左右

  
  

  ● AT含量高的microRNA得到有效检测

   

  *图释：对不同AT含量的miRNA均能有效检测

  
  ● 高特异性，能区分单碱基差异的microRNA

   

  *图释：miRCURY™ LNA芯片的高特异性

  
  

  ● 高灵敏度，可以检测普通DNA作为捕获探针的芯片不能检出的微量microRNA

   

  *图释：基于LNA的探针具有极高的灵敏度。可以检测普通DNA捕获探针不能检出的微量microRNAs；新一代microRNA芯片检出极限可达1 amol，起始总RNA量可低至30ng

  
  

  ● 杂交温度高（60℃），有效避免非特异性杂交信号
  ● 统一标记方法，无序列偏好，标记效率高，无需富集microRNA
  ● 实验结果准确，一步法标记探针，无需纯化，减少信号失真

• 1.样品RNA抽提
         a.实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，使用BioPulverizer^TM冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。
         b.实验对象为细胞样品，每份取1×10⁶~1×10⁷细胞，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（样品为贴壁细胞，每10cm²培养皿TRIzol使用量为1ml），裂解后抽提RNA。
  2. RNA质量检测
         a.使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
         b.用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
         c.提供RNA QC报告。
         注意：用于芯片检测的RNA样品，必须是高质量的，完整的，没有RNase污染（降解的样品不能用于标记和芯片检测），没有基因组污染。
  3.制备荧光标记探针
         采用miRCURY™ Array Power标记试剂盒，用标记酶将Hy3™或Hy5™荧光基团标记miRNA,可以得到用于与芯片杂交的荧光探针。
  4.芯片杂交
         在标准条件下使用MAUI杂交仪将标记好的探针和miRCURY™芯片杂交。
  5.图像采集和数据分析
         使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。
  6.提供实验报告——包括详细的实验方法和芯片实验数据及图表
         a.芯片扫描图

         b.操作说明（含RNA质检报告）
         c.芯片数据
         数据汇总表格（EXCEL格式，包含探针位置，探针名称，原始信号值，修正信号值，标准化信号值，样品间microRNA表达量的比值）
         差异表达microRNA的数据表格（EXCEL格式，包含表达上调2倍的microRNA和表达下调2倍的microRNA）
         d.进一步数据分析
         Scatter Plot（主要针对单色重复实验数据进行相关性R值计算）
         分层聚类（进行多个样品实验时，按基因表达相似程度进行聚类，从而将多个样品进行归类）
         若进行重复实验（≥3）则计算CV值、p值，并做Volcano Plot

• 1. miRNA差异表达数据

         为了便于样品间的比较，我们通过芯片中位值对miRNA芯片原始信号值进行标准化。通过标准化后的信号值计算出每个miRNA在不同样品间（如处理组vs对照组）的表达变化（fold change），并通过ttest计算样品间miRNA表达量变化的统计学显著性。那些表达变化倍数在2倍以上，p值小于0.05的miRNA被挑选出来，并定义为显著性差异表达的miRNA。针对多重比较，p值被校正为FDR。客户可以根据倍数变化，p值，FDR等参数对差异表达的miRNA进行排序和筛选。

         适用范围：两个或两只样品间的比较，建议每组样品数目大于或等于3。

  

  *图释：样品间差异表达的miRNA数据示例。

  
  

  2. 差异表达miRNA的聚类图

         层次聚类是一种最常见的用于分析表达数据的聚类方法。它可以根据样品中基因的表达水平将样品自动的分组，可以让客户从整体上评估样品间的基因表达差异，以及样品间的关系。左侧的树状图可以反映样品间基因表达模式的关系（图3）。

         适用范围：两组或多组样品的miRNA表达谱分析

   

  *图释：不同样品组之间差异表达miRNA的聚类示例。

  
  

  3. 差异表达miRNA的火山图

         火山图可以对不同样品组之间差异表达的miRNA进行图形化的展示。横轴代表处理组和对照组之间miRNA表达倍数的变化（log2转化），纵轴代表相应的p值（-log10转化）。火山图可以直观的展示miRNA在样品组间的倍数变化与相应的统计学显著性之间的关系（图5）。纵向的绿线分别对应1.5倍的上调（右侧）和下调（左侧），绿色平行线对应0.05的p值。下面火山图中的红色点代表在不同样品组中具有统计学显著性的差异miRNA（图4）。

         适用范围：两组样品间的差异miRNA分析，每组样品数目必须大于或等于3

   

  *图释：火山图示例。

  
  

  高级数据分析展示

  1)差异表达microRNAs的靶基因预测

         康成生物通过汇总三大数据库(miranda, mirbase, targetscan)的已知miRNA靶点信息,我们将三种数据库的结果交集做为最终miRNA的靶基因结果，有效的降低了靶基因预测的假阳性率，见下表。Venn图展示了对于特定miRNA列表利用上述数据库的多个预测结果的整合分析。

         适用范围：两组或多组数据比较获得的差异miRNA

  

   

  *图释：左图：康成生物miRNA靶基因预测结果的Venn图示例；右表：康成生物miRNA靶基因预测结果列表示例。

  
  

  2) microRNA—靶基因网络图

         可以从整体上挖掘miRNA和其靶基因的调控关系， 下面的网络图中红色结点为miRNA，蓝色结点为靶基因，结点大小越大说明这个节点在microRNA—靶基因相互作用网络中的位置越重要。

         适用范围：两组或多组数据比较获得的差异miRNA，一般情况下用于分析的miRNA数目应小于10个。 

  

  *图释：康成生物miRNA—靶基因网络图示例。

  
  

  3)靶基因的功能分析：Go & Pathway分析

         为了获得对microRNAs生物学功能的理解，鉴定其全部靶mRNA（靶基因）是必不可少的。康成使用多种数据库来预测人类已知microRNA靶基因。之后对这些基因的功能进行分析（GO分析和KEGG pathway分析）。

   

  *图释：A. GO分析结果展示：预测的差异表达microRNAs靶基因的前10个富集生物学过程；B. Pathway分析结果展示：预测的microRNA靶基因（CKS1、Skp2等，黄色标注）与细胞周期相关，提示microRNAs可能涉及到小细胞肺癌的发生。

  
  

  联合分析

  1) microRNA芯片与lncRNAs芯片结果联合分析（ceRNA Analysis）

         根据ceRNAs（competing endogenous RNAs，竞争性内源RNAs）假说，mRNAs、和长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，LncRNAs）间通过使用microRNA响应元件（microRNA response elements，MREs）作为一种“语言”彼此间进行“通信”， 形成一个复杂的调控网络，在病理条件下（例如癌症），发挥着重要的作用。通过联合microRNA表达谱和Arraystar LncRNA芯片结果，能够找出最有可能的ceRNA，并绘制ceRNA调控网络。

         康成生物通过MuTaMe(mutually targeted MRE enrichment )分析寻找我们感兴趣的lncRNA的ceRNAs，进而构建miRNA、lncRNA和ceRNA的调控网络，从而揭示ceRNA通过竞争性结合miRNA来调控目的lncRNA的新的调控模式

         适用范围：同时具有miRNA表达谱数据和LncRNA芯片数据的样品

    

  *图释：ceRNA分析结果展示。左侧：ceRNA网络图。右侧：针对网络图中的特定LncRNA（lincRNA-GPR180）的LncRNA-miRNA-mRNA相互作用详细信息。

  
  

  2) microRNA芯片与mRNA芯片结果联合分析

         根据表达谱芯片结果和miRNA芯片结果联合分析，进一步定位差异miRNA发挥功能的途径以及相应的差异表达靶基因可能引起的生物学通路变化。首先利用差异表达的miRNA找寻靶基因，将其与表达谱中的差异表达基因取交集。这样能找到既是差异miRNA的靶基因又在表达谱芯片中差异表达的基因，可以进一步缩小miRNA可能影响的基因的范围，能够更加准确地研究这些基因所发挥的生物学功能。

         适用范围：同时具有mRNA表达谱数据和miRNA表达谱数据的样品，一般情况下用于分析的差异miRNA数目应小于10个。

   

  *图释：康成生物microRNA芯片与mRNA芯片联合分析示例：miRNA-靶基因网络图。

  
  

  3) microRNAs与DNA甲基化芯片结果联合分析

         DNA甲基化和microRNA调控是两种重要的表观遗传现象。研究表明，特定microRNA能够作为肿瘤抑制microRNA靶向DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）。例如miR-29家族microRNA靶向DNMT 3A和3B，导致全基因组DNA甲基化的改变。同时，抑癌microRNA的启动子甲基化程度的改变也会影响癌症（例如多发性骨髓瘤）的发生。联合microRNAs和DNA甲基化芯片结果能够研究两者之间的复杂调控关系，更好地理解癌症发生的机制。

         适用范围：同时具有microRNA表达谱数据和甲基化谱数据的样品。

  

  
  

  
  

  
  

• 1. microRNA标志物筛选应用实例 

  筛选与肝移植后的肝癌复发相关的miRNA (Identification of recurrence-related microRNAs in hepatocellular carcinoma following liver transplantation.2013, Molecular Oncology.)
         肝癌(HCC)患者进行肝移植后，依然可能复发。如果复发，则预后差。目前，预后判断主要采用米兰标准和UCSC标准，这两种方法主要基于肿瘤大小和损伤数目来进行预判，并不能准确预测疾病进展和预后。该研究发现，在复发和不复发的病人之间，microRNA表达谱有明显差异。在显著变化的microRNA中，6个microRNA（miR-19a, miR-886-5p, miR-126, miR-223, miR-24 and miR-147）作为一个整体，可以做肝癌复发和病人生存的预后判断，与现有的预后判断方法，如米兰标准相比较，microRNA分子标记物准确性好，特异性强。研究者对挑选出的microRNA的功能进行了初步的探讨，发现这些microRNA参与了肝癌复发相关的信号通路中，为进一步阐明microRNA在肝癌中的作用机制奠定了基础。

  

  
  

  结果展示：

  

  *图释：芯片筛选差异表达的microRNA，可以将复发与不复发组区分开。

  

  *图释：ROC分析检测microRNA分子标记物的灵敏度和特异性

  
  

  2. microRNA的功能机制研究实例

  椎间盘退行性病变患者中的miRNA表达谱特征(Characterization of microRNA expression profiles in patients with intervertebral disc degeneration. 2014, INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE )

         本研究通过microRNA芯片筛选和PCR验证，研究者发现了在腰椎间盘突出症和脊髓损伤中表达有显著差异的microRNA。围绕这些microRNA，通过生物信息学分析预测了microRNA的靶基因和microRNA可能参与的信号通路，包括PI3K-Akt通路，MAPK信号通路，EGFR通路和Wnt信号通路等。本研究初步探讨了microRNA在IDD的发生和发展所发挥的功能。接下来，可以针对这些microRNA和相应的靶基因展开详细的功能研究，为进一步阐明IDD的分子机制，未来开发IDD的诊断试剂盒和治疗靶点选择提供初步的实验依据。

  
  

  技术路线：

  

  
  

  3. microRNA标志物筛选和功能分析联合应用实例

  MicroRNA-135a contributes to the development of portal vein tumor thrombus by promoting metastasis in hepatocellular carcinoma. 2011, JHEPAT.）

         本研究通过对人癌组织，肝癌细胞株和小鼠模型的系列实验发现，miR-135a的表达上调，可以促进PVTT转移，而这种作用可能是通过抑制MTSS1(metastasis suppressor 1)而实现的。研究还发现，转录因子FOXM1可以促进miR-135a的表达，激活miR-135a相关的信号通路。从而提出FOXM1-miR-135a-MTSS1通路。研究者进一步选取了50例肝癌和PVTT对照样本，探讨miR-135a的biomarker潜能，发现miR-135a和存在PVTT的肝癌患者的预后和生存有相关性。

  
  

  技术路线：

  

  
  

  结果展示：

  

  *图释：差异表达的microRNA的聚类分析（miRNA芯片数据）。

  

  *图释：miR-135表达量不同的病人的KM生存线（miRNA qRCR数据）。

• → Identification of miRNA-7 by genome-wide analysis as a critical sensitizer for TRAIL-induced apoptosis in glioblastoma cells. Nucleic acids research. 2017

  → Combination of AAV-TRAIL with miR-221-Zip Therapeutic Strategy Overcomes the Resistance to TRAIL Induced Apoptosis in Liver Cancer. Theranostics. 2017

  → Exploring Transcription Factors-microRNAs Co-regulation Networks in Schizophrenia.  Schizophrenia Bulletin. 2016

  → Exosomal miR-24-3p impedes T-cell function by targeting FGF11 and serves as a potential prognostic biomarker for nasopharyngeal carcinoma. J Pathol.  2016

  → Reprogramming of Normal Fibroblasts into Cancer-Associated Fibroblasts by miRNAs-Mediated CCL2/VEGFA Signaling. PLos Genetics.  2016

  → Tumor-suppressive miR-26a and miR-26b inhibit cell aggressiveness by regulating FUT4 in colorectal cancer.Cell Death & Disease. 2017

  → SOX2 regulates multiple malignant processes of breast cancer development through the SOX2/miR-181a-5p, miR-30e-5p/TUSC3 axis. Molecular Cancer. 2017

  → Increased Variability of Genomic Transcription in Schizophrenia. Scientific Reports. 2016

  → microRNA-802/Rnd3 pathway imposes on carcinogenesis and metastasis of fine particulate matter exposure. Oncotarget. 2016

  → Role of microRNA-4516 involved autophagy associated with exposure to fine particulate matter. Oncotarget. 2016

  → MicroRNA-1185 Induces Endothelial Cell Apoptosis by Targeting UVRAG and KRIT1. Cellular Physiology and Biochemistry. 2017

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